抗体制备理论知识
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质，广泛应用于医学诊断、治疗和研究领域。
抗体的制备方法包括动物免疫和体外选择性放大两种主要途径。
以下将详细介绍这两种方法及其原理。
一、动物免疫法制备抗体动物免疫法是制备多种特异性抗体的主要方法，常用的动物包括小鼠、兔子、大鼠等。
制备抗体的主要步骤如下：1.抗原选择：首先需要选择目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白、核酸等。
抗原应具有免疫原性，能在动物体内引起免疫反应。
2.免疫原免疫：将抗原与适当的佐剂混合后注射到动物体内，佐剂可以增强抗原的免疫原性，如完全弗氏佐剂、佐科克佐剂等。
注射的剂量和时间间隔需根据具体实验目的和动物种类进行优化。
3.收集血清和分离抗体：免疫一定时间后，收集动物的全血或血清，离心分离血清，其中包含了目标抗体。
4.抗体纯化：通常使用亲和层析、凝胶过滤层析等方法将血清或血浆中的抗体纯化出来。
亲和层析是最常用的抗体纯化方法，利用特定配体或抗原结合柱将目标抗体捕获，再洗脱得到纯抗体。
二、体外选择性放大法制备抗体体外选择性放大法是指通过技术手段进行人工放大和筛选特定抗体，主要包括以下步骤：1.生成抗体文库：将来自多个个体免疫系统的B细胞或血浆细胞收集起来，提取RNA或DNA，然后利用逆转录酶合成cDNA或文库，得到抗体基因的cDNA文库。
2.构建抗体显示系统：将抗体基因文库插入适当的表达载体中，如噬菌体、酵母、哺乳动物细胞表达系统等。
3.筛选特异性抗体：利用高通量筛选技术，如细胞表面展示、比对深度测序等，可通过抗原结合的特异性来筛选出具有高亲和力的抗原结合片段或全长抗体。
4.抗体表达和纯化：通过选择后的抗体基因进行表达，再经过蛋白纯化和检验等步骤，最终得到目标抗体。
抗体制备的原理主要是基于免疫系统的免疫应答机制。
当机体受到抗原的刺激后，机体会产生一系列免疫应答，其中包括B细胞的活化和分化。
经过抗原的结合和识别，B细胞会分泌具有高亲和力的抗体。
抗体制备原理
抗体制备原理抗体是一种特异性蛋白质，能够识别并结合到其特定的抗原上。
抗体的制备原理是通过免疫原性物质刺激机体产生特异性抗体，或者通过体外培养细胞（如淋巴细胞、骨髓细胞等）制备。
抗体制备的过程中，需要经历抗原的选择、免疫原的制备、动物免疫、抗体的纯化等步骤。
首先，抗体的制备需要选择合适的抗原。
抗原是能够诱导机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、糖类、核酸等。
在选择抗原时，需要考虑其免疫原性、稳定性和纯度等因素。
通常情况下，选择具有较强免疫原性的抗原能够更好地诱导机体产生高效的抗体。
其次，制备抗体需要进行免疫原的制备。
免疫原的制备是将选择好的抗原溶解在适当的缓冲液中，使其保持稳定性，并且能够有效地诱导机体产生抗体。
制备好的免疫原需要进行一系列的检测，确保其纯度和活性符合要求。
接着，进行动物免疫。
通常情况下，选择小鼠、大鼠、兔子等动物进行免疫。
在免疫前，需要对动物进行适当的准备工作，如体重测量、免疫程序的安排等。
在免疫过程中，需要根据抗原的特性和动物的生理状态，合理地确定免疫剂量和免疫方案，以确保免疫效果的最大化。
随后，进行抗体的纯化。
在动物免疫一定周期后，可以从动物体内获取免疫血清，其中含有特异性抗体。
但免疫血清中还会含有大量的非特异性蛋白质和其他成分，需要进行纯化。
常用的纯化方法包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等。
通过这些方法，可以将目标抗体从杂质中分离出来，得到纯净的抗体制剂。
最后，对制备好的抗体进行鉴定和检测。
鉴定抗体的纯度、活性、特异性等指标，确保其符合质量标准。
同时，也需要对抗体进行存储和保存，以确保其长期的稳定性和活性。
抗体制备原理是一个复杂而精细的过程，需要在每一个环节都严格控制，才能获得高质量的抗体制剂。
通过对抗体制备原理的深入了解，可以更好地指导抗体制备工作的实施，为科研和临床应用提供优质的抗体产品。
第03章抗体制备
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取 抗体；
使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一 的特异性IgY；
噬菌体抗体库主要工作流程
从外周血或其他免疫组织器官克隆出全套抗体基因菌体表达，构建全部Ig cDNA的噬菌体抗体库。
筛选含有目的Ig表达的噬菌体。 建立目的Ig表达的噬菌体抗体库。 扩增制备噬菌体抗体。 纯化抗体。
噬菌体抗体库技术的主要特点
IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在， 因此容易保存和运输；
由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免 疫球蛋白之间不会发生交叉反应；
IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或 Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳 性结果；
IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
抗体的制备原理及其应用实验
抗体的制备原理及其应用实验1. 引言抗体是一类由人体或动物体内产生的免疫分子，具有识别并结合特定抗原的能力。
抗体的制备原理包括免疫原制备、免疫动物的选择、免疫方法、抗体纯化和鉴定等。
在实验室中，抗体的制备得以广泛应用于生物学、医学以及其他领域的研究和实验中。
2. 抗体制备的基本原理抗体制备的基本原理是通过免疫动物对抗原的免疫反应，使其体内产生特异性抗体。
具体步骤如下：•第一步：免疫原制备–收集目标抗原，如蛋白质或多肽片段。
–对抗原进行纯化和浓缩，确保纯度和活性。
•第二步：免疫动物的选择–选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或大鼠等。
–考虑动物的抗原相似性和体积适宜性。
•第三步：免疫方法–给免疫动物注射抗原，刺激其免疫系统产生抗体。
–定期采集免疫动物的血样，分离抗体。
•第四步：抗体纯化和鉴定–使用技术如亲和层析、离子交换层析等纯化抗体。
–使用免疫学方法验证抗体的特异性和活性。
3. 抗体应用实验抗体的制备在实验中具有广泛的应用价值，以下列举了一些常见的抗体应用实验：•酶联免疫吸附（ELISA）–抗体可用于ELISA实验，通过与特定抗原结合来检测其存在和浓度。
–ELISA广泛应用于血清学、药物检测、疾病诊断等方面。
•免疫组织化学（IHC）–抗体可用于IHC实验中，通过与组织中的抗原结合来检测其在组织中的位置和表达水平。
–IHC可用于病理学研究、癌症诊断等领域。
•免疫印迹（Western Blot）–抗体可用于Western Blot实验，通过与目标蛋白结合来检测其在细胞或组织中的表达水平。
–Western Blot广泛应用于蛋白质研究和疾病诊断等方面。
•流式细胞术–抗体可用于流式细胞术实验，通过与细胞表面或内部特定抗原结合来分析细胞的类型和数量。
–流式细胞术在免疫学、细胞生物学研究中得到广泛应用。
•免疫疗法–抗体可用于免疫疗法中，通过结合肿瘤细胞表面的抗原，识别和杀伤肿瘤细胞。
–免疫疗法是目前肿瘤治疗的重要方法之一。
抗体的制备方法与原理
抗体的制备方法与原理一、抗血清的制备有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
（一）用于免疫的动物作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
（二）免疫途径免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
（三）佐剂由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg 卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
抗体制备
一、多克隆抗体
用抗原免疫动物后获得的免疫血清（ 抗血清），由不同克隆的B细胞针对不 同抗原决定簇所产生得多种免疫球蛋 白。
二、 单克隆抗体
• 概念： 一个B细胞针对一个抗原决定簇所产生 的一种特异性抗体 • 特点： 高特异性、高均一性 • 应用广泛
单克隆和多克隆抗体的比较和用途
特异性 敏感性 均一性 PcAb 低 差 无 McAb 高 强 有
1、用于免疫学检测，辅助临 床诊断
2、McAb用于亲和层析，分 离微量可溶性抗原
3、标记的McAb用于基础研 究，了解细胞分化等 4、制备生物导弹用于肿瘤、 移植等的临床治疗。
三、基因工程抗体
• 解决抗体的鼠源性问题 • 制备部分或完全人源化抗体 1. 将部分或完全人源化抗体的编码基因克 隆到真核或原核表达系统，体外表达人 －鼠嵌合或人源化抗体。 2. 转基因至剔除自身抗体编码基因的小鼠 体内，主动免疫诱生人源抗体。
详细介绍抗体的生产制备
详细介绍抗体的生产制备抗体是一种由人类或动物免疫系统产生的蛋白质分子，用于识别和抵御入侵体内的外来抗原，如细菌、病毒或其它异物。
它们起到了非常重要的免疫调节和防御作用。
抗体的生产制备可以通过以下步骤进行：免疫原选择、免疫动物筛选、抗原接种和免疫、细胞融合和克隆、抗体纯化和检测。
首先，选择合适的免疫原。
免疫原一般是指从目标病原体中提取出的具有抗原性的物质。
免疫原可以是细菌、病毒、真菌、寄生虫等。
选择合适的免疫原非常重要，因为它决定了抗体的特异性和亲和性。
其次，选择合适的免疫动物。
大多数情况下，小鼠是最常用的免疫动物。
它们具有一种高度多样化的基因组和良好的免疫系统。
其他常用的免疫动物还包括兔子、猴子、鸟类等。
第三，进行抗原接种和免疫。
将免疫原注射到免疫动物的体内，触发其免疫系统产生特异性抗体。
免疫过程可以通过多次接种来增强免疫效果。
根据需要，可以选择不同的免疫方法，如小鼠腹腔注射、小鼠尾静脉注射、兔子皮下注射等。
接下来的步骤是细胞融合和克隆。
细胞融合是将免疫细胞与肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞拥有免疫细胞的能力和肿瘤细胞的无限增殖能力。
杂交瘤细胞可以在体外持续产生特异性抗体，这使得抗体的大规模生产成为可能。
接下来，通过限稀克隆的方法，从杂交瘤细胞中筛选出特异性抗体的产生细胞株。
最后，抗体纯化和检测。
通过对培养物中的细胞和抗体的分离，可以获得纯化的抗体。
这可以通过多种方法实现，如亲和层析、凝胶渗透层析和蛋白质A/G结合等。
检测抗体的纯度和活性也是十分重要的。
常用的方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹（Western blotting）和流式细胞术等。
总结起来，抗体的生产制备是一个复杂的过程，需要经过免疫原选择、免疫动物筛选、抗原接种和免疫、细胞融合和克隆、抗体纯化和检测等多个步骤。
这些步骤都需要仔细和精确地操作，以确保最终获得高质量和高效能的抗体产品。
抗体的生产制备能够为医学研究和临床诊断提供重要的工具和方法。
抗体的制备
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C、凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子 进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、 中、小三种。属区带分离法。
D、离子交换层析：利用带离子基团的纤 维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。
凝胶过滤层析( 分子筛)的作用机理
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E、亲和层析：利用生物学分子间所具有的 专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab, 激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。
但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉 芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。
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(四)免疫动物
+ 为获取高质量(特异性强和效价高)的 抗体，除了需制备质量好纯度高的抗 原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、 剂型、注射途径、注射次数、注射间 隔和接种动物的年龄均与免疫效果密 切的关系。
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B、冷热交替法：将材料投入沸水中，90 ℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。 在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用 此法。
C、超声波破碎法：是利用超声波的机械振 动而使细胞破碎的方法。微生物和组织 细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则 较难打破。
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D、酶处理法：酶在一定的条件下能消化 细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶 菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用 于多种微生物。
C、新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。
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(2)细菌抗原的制备：取标准菌株，接种。 H抗原：取有动力的菌株液，用 0.3~0.5%甲醛处理。 O抗原：菌液于100℃2.5h。 Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶 液。
(3)虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫 卵悬液。
3.抗体的人工制备
第三章抗体的人工制备由一个祖先细胞增殖而形成的一群细胞称为克隆(clone，无性繁殖系)一个B细胞克隆只能产生针对一种抗原表位的抗体;一个浆细胞只能分泌一种类型的抗体第1节多克隆抗体一、多克隆抗体的概念①将抗原物质经不同途径注入动物体内，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，由此获得的抗血清即为多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)，简称多抗。
②从天然感染康复动物采取的血清。
无论是细菌抗原，还是病毒抗原，都含有多种抗原成分。
即使是纯蛋白质抗原分子也含有多种抗原表位，进入机体后可激活多种淋巴细胞克隆，机体可产生针对各种抗原或抗原决定簇(表位)的抗体, 由此获得的抗血清是一种多克隆的混合抗体，具有高度的异质性。
进一步讲，针对同一抗原决定簇的抗体仍是由不同B细胞克隆产生的不同质的抗体。
二、多克隆抗体制备的基本过程1.抗原制备2.动物免疫3.试血测定抗体效价4.血清分离与保存5.多抗纯化与标记三、多克隆抗体的用途1.用于血清学实验——作为阳性血清或标记抗体(血清凝集实验/沉淀实验/补体结合实验/中和实验/免疫标记技术/免疫转印技术) 2.治疗制剂——可用于一些传染病的紧张预防和治疗第 1 页/共 6 页第2节单克隆抗体一、单克隆抗体的概念单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。
将产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤，这种杂交瘤细胞既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有B细胞分泌特异性抗体的能力，由克隆化的B细胞杂交瘤产生的抗体即为单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)，简称单抗。
二、单抗与多抗的比较与多克隆抗体比较，单克隆抗体具有无可比拟的优越性：高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低并可大量生产等。
三、建立B细胞杂交瘤与单克隆抗体的制备1.B细胞的制备小鼠脾细胞悬液2.骨髓瘤细胞的制备免疫相同来源的小鼠骨髓瘤细胞3.饲养细胞的决定融合之前, 将饲养细胞制成所需的浓度参加培养板孔中。
抗体制备过程
抗体制备过程
抗体的制备过程可以分为免疫原制备、动物免疫、抗体分离和纯化几个步骤。
1. 免疫原制备：首先需要获得想要制备抗体的免疫原，免疫原可以是细胞、蛋白质、多肽、核酸等。
制备免疫原时需要注意保持其生物活性和完整性，以使其能够充分诱导动物产生抗体。
2. 动物免疫：将制备好的免疫原注射到动物体内，如小鼠、兔子、绵羊等，以刺激其产生抗体。
注射方式可以选择皮下注射、肌肉注射或静脉注射等。
3. 抗体分离：在动物体内产生的抗体经血液循环后进入血清中，需要将血清从动物体内取出并离心分离血浆。
将血浆中的抗体以其特异性与含免疫原的材料结合并沉淀，然后分离抗体。
4. 抗体纯化：对分离出来的抗体进行纯化处理，去除其他杂质和不必要的成分，得到纯净的抗体物质。
纯化方法可以包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等方法。
最终制备的抗体可以用于医学研究、生物诊断、治疗等领域。
基因工程抗体制备原理
基因工程抗体制备原理
1. 靶抗原选择：根据需要制备的抗体的特定功能和应用领域，选择合适的靶抗原。
靶抗原可以是纯化的蛋白质，细胞表面分子等。
2. 基因克隆：将靶抗原的基因序列克隆到适当的表达载体中，例如质粒或病毒载体。
这个过程通常涉及使用限制性内切酶切割目标基因和载体，并通过DNA连接酶将它们连接起来。
3. 转染宿主细胞：将重组载体导入宿主细胞，使其表达靶抗原基因。
可以使用多种方法进行转染，包括电穿孔、高压转染或病毒介导的转染。
4. 细胞培养与表达：培养被转染的宿主细胞，在适当的培养基中表达靶抗原。
这些细胞通常是哺乳动物细胞，如CHO细胞。
5. 抗体纯化：通过多种分离技术将抗体从培养物中纯化出来。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
6. 抗体测试和鉴定：通过各种实验方法，如ELISA、Western blot等，验证所制备的抗体的特异性和相关功能。
基因工程抗体制备利用了基因重组技术和细胞工程技术，能够高效、精确地制备特定的抗体，具有广泛的应用前景。
抗体制备原理
抗体制备原理抗体是一种特殊的蛋白质，它在免疫系统中起着重要的作用，能够识别和结合特定的抗原分子。
抗体制备是指通过一系列的实验操作，从动物或体外细胞培养物中获得特定的抗体。
下面我们将介绍抗体制备的原理及其相关的实验步骤。
首先，抗体制备的原理是基于免疫反应的原理。
当外源抗原进入机体后，机体的免疫系统会产生对应的抗体，以保护机体免受外源抗原的侵害。
在实验室中，我们可以利用这一原理，通过注射抗原来激发动物的免疫反应，或者在体外培养细胞，使细胞产生特定的抗体。
其次，抗体制备的实验步骤包括抗原的选择、动物免疫、细胞培养、抗体纯化等环节。
首先，我们需要选择合适的抗原，通常选择纯化的蛋白质或多肽作为抗原。
然后，将抗原注射到动物体内，激发其免疫反应，产生特定的抗体。
对于体外细胞培养，我们需要将细胞培养在含有抗原的培养基中，使细胞产生抗体。
最后，通过亲和层析、离子交换层析等技术，我们可以将抗体从混合物中纯化出来。
在抗体制备的过程中，需要注意一些实验技术和条件。
例如，在动物免疫的过程中，需要控制好抗原的剂量和免疫的时间，避免过度刺激动物免疫系统。
在细胞培养过程中，需要保证培养基的质量和细胞的健康状态，以确保抗体的产生和稳定性。
在抗体纯化过程中，需要选择合适的纯化技术和条件，以保证抗体的纯度和活性。
总之，抗体制备是一项重要的实验技术，它在生物医学研究和生物制药领域有着广泛的应用。
通过对抗体制备原理的深入理解和实验操作，我们可以获得高质量的抗体，为科学研究和临床诊断提供有力的支持。
希望本文能够对抗体制备的原理有所帮助，谢谢阅读！。
免疫学--抗体制备
脾是B细胞聚集的重要场所，致敏B细胞 主要来源于脾脏。
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术: 利用细胞融合技术，将具有分泌特异性抗体能
力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞 融合为B细胞杂交瘤的技术。
（一）亲本细胞的选择与融合 1．致敏B细胞:抗原诱导B细胞(脾细胞)
2．骨髓瘤细胞:能在体外长期增殖并易与B细 胞融合
3.融合剂:PEG
1．致敏B细胞 用抗原免疫BALB/C小鼠，使机体B细胞
5．亲和层析
亲和层析是利用生物大分子与其配体之间所具 有的专一亲和力而设计的层析技术。
只要将对应体系中的一方偶联于不溶性支持物 上，就可从混合物中专一地分离和提纯相应的另一 方。
亲和层析法
正常细胞 标记细胞 标记细胞 加入特异 其它蛋白 SDS-PAGE
＋ 洗滴
被酶裂解 性抗体 洗涤流失 分离蛋白
原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。
由于超声波发生的空化作用,使得液体形成局部减 压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产 生很大的压力，使细胞破碎。
(3)冻融法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶 剂浓度的突然改变而破坏细胞。 •方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢 融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的 颗粒可被融破。
第2组：主要是IgG和较少量的IgA、IgD、IgE；
第3组：主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白等。
3．亲和层析法 两种类型的层析柱： ①将抗原交联Sepharose 4B制成亲和层析柱；
②IgG与层析柱上SPA发生特异性结合，洗脱除 去未结合的蛋白后，改变洗脱液的pH或离子 强度，可使IgG从层析柱上解离，纯化IgG。
抗体的制备
抗体的制备为了研究抗体的理化性质、分子结构与功能，以及应用抗体于临床疾病的诊断、治疗及预防都需要人工制备抗体。
目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。
一、多克隆抗体大多数抗原是由大分子蛋白质组成，但只是抗原上有限部位的特殊分子结构能与其相应抗体结合，称此部位为抗原决定簇（antigenic determinant）或表位(epitope)。
一种天然抗原性物质（如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等）往往具有多种不同的抗原决定簇，而每一决定簇都可刺激机体一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。
在机体淋巴组织内可存在千百种抗体形成细胞（即B细胞），每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇，当受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群，这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称之为细胞克隆（clone）。
同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体，亦可称之为单克隆抗体。
在早期传统的抗体制备方法是将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种抗原决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体，也是第一代抗体。
由于这种抗体是不均一的，无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制，因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题。
二、单克隆抗体体内免疫法很难获得单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。
如能将所需要的抗体形成细胞选出并能在体外进行培养即可获得已知特异的单克隆抗体。
1975年德国学者Kohler 和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞（sheep rue blood cell），SRBC）免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞融合，结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体，称这种杂交细胞系为杂交瘤（hybridoma）。
抗体制备原理
抗体制备原理
抗体制备原理：
抗体是免疫系统中一种特殊的蛋白质，能识别和结合到体内外的抗原分子，并参与免疫反应。
抗体制备是通过免疫原与免疫动物（如小鼠、兔子等）的免疫系统进行相互作用，使免疫动物产生特异性抗体的过程。
抗体制备一般包括以下几个关键步骤：
1. 免疫原选择：选择与目标抗原相关的合适免疫原，可以是蛋白质、多肽、糖蛋白等。
免疫原通常需要具备良好的纯度和完整性。
2. 免疫动物免疫：将选择的免疫原注射到免疫动物体内，通常会进行多次免疫，以激活免疫系统，使其产生针对免疫原的特异性抗体。
3. 抗体检测：在免疫动物免疫一段时间后，通过抗体检测方法（如ELISA、Western blot等）检查免疫动物体内是否已产生特异性抗体。
可选用已知抗原的标准抗体对比，以确定产生的抗体特异性。
4. 免疫细胞融合：将免疫动物的脾细胞或淋巴细胞提取出来，并与骨髓瘤细胞进行融合。
骨髓瘤细胞是一种恶性细胞，具有无限增殖潜力，融合后能够长期保存抗体合成所需的基因。
5. 杂交瘤筛选：将融合细胞进行限稀稀释，使其单个细胞分散
于培养基中，便于各个细胞独立地生长。
然后通过对培养基中的细胞进行筛选，选择出能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体培养：将筛选出的杂交瘤细胞进行分离和培养，使其形成单克隆细胞株。
每个单克隆细胞株都来自于同一个B 细胞，因此能够产生具有相同抗原特异性的抗体。
7. 抗体纯化：将培养出的单克隆抗体进行纯化，去除杂质和不需要的成分，得到高纯度的抗体样品。
以上是一般的抗体制备原理，不同实验室和具体实验会根据需要和条件进行微调或改进。
抗体的制备(一)
抗体的制备（一）抗体是动物机体在抗原刺激下，由B细胞分化成熟的浆细胞合成的，并能与抗原特异性结合的一类球蛋白，亦称免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。
高等哺乳动物体内普通有4种免疫球蛋白，即IgM、IgG、IgA、IgE，在免疫分析中常用的是IgG。
IgG的分子量为150～160kD，在动物血清中的含量约为6～16mg·mL-1，占血清蛋白总量的75％。
IgG的基本结构类似英文大写的“Y”形，8-1所示。
IgG由两条轻链(图中浅色部分)和两条重链(图中深色部分)组成，轻链和重链及重链和重链之间通过二硫键(-S-S-)衔接。
重链从其氨基端开头的1/4区域和轻链从其氨基端开头的1/2区域内的组合成抗原结合部位。
由图8-1可以看出，一个IgG分子可以有两个抗原结合部位。
用木瓜蛋白酶水解IgG，可以得到两个Fab片段和一个Fc片段。
同种生物的IgG，Fc 片段基本保持不变，称为稳定区，该区域有与金色葡萄球菌蛋白A结合的位点；Fab片段从其氨基端开头的1/2区域，对不同的抗原有不同的氨基酸序列和空间结构，称为可变区，该区域是抗原识别部位。
因为IgG分子的抗原识别部位在“Y”，形结构的最顶端，这对于抗体的固定化具有重要意义：人们可以通过与Fc片段的特异性结合而把抗体固定在固相载体上。
同时使抗原结合部位充分裸露，以保持抗体的活性。
图8-1 抗体基本结构暗示图凡能刺激肌体产生抗体，并能与之结合引起特异性免疫反应的物质称为抗原。
物质刺激肌体产生抗体的特性称为免疫原性，与相应抗体发生免疫亲和反应的特性称为反应原性。
对一些大分子物质，如蛋白、多糖来说，既有免疫原性又有反应原性，因此可以挺直用来免疫动物制备抗体，这些物质又称为彻低抗原。
而对于环境分析中的大多数目标化合物来说，因为分子量较小，所以只具有反应原性而不具有免疫原性，不能挺直刺激肌体产生抗体。
但是。
可以通过化学反应将目标化合物或目标化合物的特征结构结合到载体蛋白上，使之获得免疫原性，然后免疫动物，即可得到目标化合物或特征结构的抗体。
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一、抗体制备相关概念概述（一）多克隆抗体的概念抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B 淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体（Monclone antibody）。
由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE 和IgD 等五类抗体。
（二）免疫动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。
动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。
如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。
由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。
抗原是多种多样的，而且千差万别。
就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。
就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。
为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA 文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。
不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。
抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。
剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。
在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。
蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。
一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。
加强计量为首次剂量的1／5～2／5。
免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。
加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10 倍以上。
如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。
如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。
免疫周期长者，可少量多次。
免疫周期短者，应大量少次。
两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。
一般间隔时间应为5~7 天，加佐剂者应为2 周左右。
注射的Ig 纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。
（三）佐剂的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
1．佐剂的类型 目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。
也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。
⑴ 弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）羊毛脂 1 份石蜡油 5 份混合，高压灭菌后保存。
用时加热融化，冷却至50℃左右，加抗原进行乳化处理。
⑵ 弗氏完全佐剂（complete Freund's adjuvant,CFA）弗氏不完全佐剂 10ml卡介苗 10mg～200mg卡介苗可100℃10min 灭活处理。
初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺激机体产生较强的免疫反应。
再次免疫时，一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐剂。
但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干扰。
⑶ 脂质体：是人工制备的类脂质的小球体，由一个或多个酷似细胞膜的类脂双分子层组成，这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性物质，他们被包裹在脂质体内部的水相中，或插入类脂双分子层或吸附、联接在脂质体的表面，起到明显的免疫增强作用。
⑷ 油佐剂 ：采用植物油和矿物油均可，包括豆油、花生油、油菜油等。
目前应用最广的矿物油。
10 号白油(石蜡油) 100ml硬脂酸铝 2g司本80 6ml混合加热融化，分装。
用时按下列配方进行乳化。
油相 3 份水相（加4%吐温－80） 1 份先把油相搅拌起来，然后缓慢加入水相乳化。
司本是油分散剂，吐温是水分散剂，均有利于乳化。
2．乳化 将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。
乳化的方法很多，可采用研钵乳化；可直接在旋涡振荡器上乳化；可用组织捣碎器乳化。
少量时，特别是弗氏佐剂与抗原乳化时，常采用注射器乳化，用两个注射器，一个吸入抗原液，一个吸入佐剂，两注射器头以胶管连接，注意一定扎紧，然后来回抽吸。
当大量乳化时，可采用胶体磨进行。
乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。
如出现平展扩散即为未乳化好。
乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。
根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。
免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。
抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射。
注射间隔时间 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2～4 周免疫一次。
不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5 天左右的间隔时间。
可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。
（四）抗体的鉴定1.抗体的效价鉴定 不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体的目的都是要求较高效价。
不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一。
鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。
常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法，以资比较。
如制备抗抗体的效价，一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。
2.抗体的特异性鉴定 抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。
抗体的特异性高，它的识别能力就强。
衡量特异性通常以交叉反应率来表示。
交叉反应率可用竞争抑制试验测定。
以不同浓度抗原和近似抗原分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC50时的浓度，并按下列公式计算交叉反应率。
如果所用抗原浓度IC50浓度为pg/管，而一些近似抗原物质的IC50浓度几乎是无穷大时，表示这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似为0，即该血清的特异性较好。
3.抗体的亲和力 是指抗体和抗原结合的牢固程度。
亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。
有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。
亲和力常以亲和常数K表示，K的单位是L/mol，通常K的范围在108～1010/mol，也有多达1014/mol。
抗体亲和力的测定对抗体的筛选，确定抗体的用途，验证抗体的均一性等均有重要意义。
（五）抗血清的冻存抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。
注意避免反复冻融。
也可将抗血清冷冻干燥后保存。
二、抗体与大分子多价抗原的反应1．多抗原决定簇——大分子抗原的特征能与一个抗体结合的大分子抗原的特异性部分称为抗原决定簇(antigen determinants)。
一个大分子抗原常常有多个抗原决定簇而成为多价抗原。
抗原决定簇的序列结构已清楚的称为抗原表位(epitope)。
半抗原相当于一个抗原决定簇。
大分子抗原上含有多个抗原决定簇能与相应的特异抗体结合。
在一些情况下，决定簇之间相距较远的各自与抗体结合而互不影响，这种决定簇是不重叠的决定簇。
当一个抗体与某一决定簇结合后，在空间上干扰了其他抗体与相应决定簇的结合，这些靠得较近的决定簇称为重叠决定簇。
在少数情况下，前一抗体的结合导致抗原结构的空间变化，影响了另外抗体的结合，称为变构效应(allosteric effect)。
许多大分子如蛋白质、核酸、复合多糖常常形成重复结构，因而每个分子内有多个相同的抗原决定簇。
颗粒性抗原细胞、细菌及病毒等还可形成多亚基聚合物，也可产生重复的抗原决定簇，成为多价的(multivalent)抗原。
单抗原决定簇的分子即半抗原可吸附在固相载体上，其结构也类似多价抗原，如ELISA 中的包被抗原，其结合特性和溶液中单价抗原有所不同。
2．抗原抗体的亲和力和亲合力单价抗原与抗体反应取决于亲和力(affinity)的大小，而天然多价抗原与小分子半抗原不同，含有1个以上的抗原决定簇，因此能与1个以上的抗体结合。
如果没有空间限制，对重复的多价抗原分子，一个IgG或IgE分子有两个结合位点，而—个IgM有10个结合位点。
对任何一个位点的亲和力是不变的，总的结合强度包括抗体上所有的结合位的亲和力，抗体对抗原分子总的结合强度，称为亲合力(avidity)。
亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度增加不仅仅是亲和力的简单相加，而是呈几何级数上升的。
因此，一个低亲和力的IgM分子，或者多个低亲和力的IgG分子对一个多价抗原的结合是相当紧密的。
3．抗体与多价抗原结合的浓度带现象抗体与单价抗原形成的复合物都是可溶性的，但抗体与多价抗原形成的复合物大多数能形成沉淀。
沉淀反应可用于研究抗体与大分子抗原结合的特性。
用非蛋白大分子(如多糖)抗原与相应抗体形成的沉淀，其中只有抗体是蛋白质，为抗体的定量测定提供了方便。
在一定量的抗体中，逐渐增加抗原浓度，沉淀的形成与抗原抗体的比例密切相关。
下图是典型的单特异性沉淀曲线。
沉淀反应的曲线分为3个区：抗体过量区，抗原与抗体形成小分子复合物，不形成沉淀或沉淀很少，称为前带(pro－zone)现象；抗原过量区，虽然没有游离的抗体，但沉淀仍很少，称为后带(post—zone)现象；在抗原抗体等带区(equi—zone)形成大量沉淀，也没有游离的抗原和抗体存在。
如果抗原是多抗原决定簇的多价抗原如细菌、细胞、乳胶颗粒等表面，则形成凝集反应。
抗原抗体相遇时，不管二者比例如何，很快发生特异性结合，一般在几秒钟内完成，称为初级反应阶段。