甘蔗几丁质酶基因的电子克隆与生物信息学分析_苏亚春

第9卷第4期2011年12月生物信息学China Journal of Bioinformatics Vol．9No．4Dec．，2011收稿日期：2010－03－08；修回日期：2011－04－27.基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS －20）；国家自然科学基金（30700514和31101196）。

作者简介：苏亚春，女，汉族，福建晋江，硕士研究生，E －mail ：syc2009mail@163．com.*通讯作者：许莉萍，女，汉族，福建莆田，博士，博导、研究员，E －mail ：xlpmail@yahoo．com．cn doi ：10.3969/j．issn．1672－5565．2011．04．13甘蔗几丁质酶基因的电子克隆与生物信息学分析苏亚春，李国印，阙友雄，郭晋隆，徐景升，许莉萍*（福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室，福建福州350002）摘要：用电子克隆方法获得甘蔗几丁质酶基因SCCHI1，采用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性、亚细胞定位、高级结构及功能域等方面进行了预测和分析。

结果表明：SCCHI1基因全长1236bp ，包含一个完整的990bp 的ORF ，编码329个氨基酸。

SCCHI1基因属于糖苷水解酶19家族，含有N －端信号肽、交连区、催化区，与高粱等其它植物的几丁质酶基因具有高度的相似性。

为SCCHI1基因的分子克隆、功能鉴定和应用提供参考。

关键词：甘蔗；几丁质酶基因；电子克隆；生物信息学中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1672－5565（2011）－04－322－06In silico cloning and characterization of chitinase gene fromsugarcane using bioinformatics toolsSU Ya －chun ，LI Guo －yin ，QUE You －xiong ，GUO Jin －long ，XU Jing －sheng ，XU Li －ping *（Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement ，Ministry of Agriculture ，Fujian Agriculture ＆ForestryUniversity ，Fuzhou Fujian ，China ）Abstract ：A novel chitinase gene SCCHI1from sugarcane （Saccharum officinarum ）was cloned in silico based on the corresponding sugarcane EST sequences in NCBI database．Some characters of amino acids encoded by SCCHI1gene ，including the composition of amino acid sequence ，physical and chemical properties ，transmembrane do-main ，hydrophobicity /hydrophilicity ，subcellular localization ，secondary and tertiary structure of protein plus the functional domain ，were analyzed by bioinformatics tools．Bioinformatic analysis showed that the full －length SC-CHI1gene from sugarcane was 1236bp and it contained a complete ORF which encoded 329amino acids．Fur-thermore ，SCCHI1belonged to glycoside hydrolase family 19and contained a N －terminal signal peptide ，a hinge region and a catalytic domain ，which was highly conservative among chitinases from several different plant species．The results above provided some references for experimental cloning of SCCHI1gene from sugarcane ，identification and its application．Keywords ：Saccharum officinarum ；Chitinase gene ；In silico cloning ；Bioinformatics 几丁质酶（EC3．2．1．14）是一种降解几丁质的糖苷酶。

普遍认为几丁质酶与植物体内防御系统有关，是一种重要的病程相关蛋白［1］。

高等植物本身不含几丁质，但当其受到真菌、细菌或病毒感染时，植物几丁质酶活性迅速提高，通过抑制病原真菌的孢子萌发和菌丝生长、破坏细胞新物质的积累，使植物获得系统性抗性［2］。

因此，几丁质酶在植物保护尤其在抗真菌病害中的重要作用，越来越受到研究者的关注，已经成为抗真菌病害的研究热点之一。

迄今，已从近100种植物中检测出几丁质酶活性，许多植物几丁质酶基因已被克隆，但甘蔗几丁质酶方面的研究报道还较少［3，4］。

电子克隆技术（in silico cloning ）是基于生物学数据库中EST （expressed sequence tag ，表达序列标签）数据库、核酸序列数据库和蛋白质数据库等，利用生物信息学工具和计算机技术，采用序列同源比对和聚类分析、重叠区域组装和拼接等方法不断延长EST序列，从而快速获得功能基因的方法［5，6］。

该技术具有效率高、成本低、针对性强等优点。

目前，利用电子克隆获得植物新基因的报道日益增多［7－10］。

本研究以NCBI数据库中甘蔗EST序列为基础，电子克隆获得甘蔗中编码几丁质酶基因的cD-NA序列，而后利用生物信息学方法，对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、亲/疏水性、亚细胞定位及三级结构等方面进行预测和分析，为后续通过实验手段分离和鉴定甘蔗几丁质酶基因奠定基础。

1材料与方法1．1电子克隆获得新基因序列以玉米（Zea mays）chiI基因（序列登录号：AY532757．1）作为查询探针，利用NCBI中的Blast 工具，搜索甘蔗EST数据库，对得到的同源性甘蔗EST序列进行聚类、拼接、延伸，并以新获得的重叠群（Contig）为新探针，继续搜索EST数据库，直到没有新的甘蔗EST可供拼接为止。

将拼接完成的新基因序列在非冗余数据库中进行比对搜索，确认为新基因序列。

1．2生物信息学分析核酸及氨基酸序列组成分析、开放阅读框（open reading frame，ORF）的查找和翻译、编码蛋白的理化性质分析，分别采用DNAstar软件及ORF Finder、Prot－Param、pI/Mw等在线工具完成；信号肽预测采用SignalP3．0Server软件完成；亲水性/疏水性分析利用在线工具ExPASy－ProtScale完成；编码蛋白的亚细胞定位通过软件psort进行预测；蛋白质二级及三级结构的预测利用SOPMA和ESyPred3D等在线工具完成［9，11］；核酸和氨基酸序列的同源性比对及多序列比对借助于Blast在线工具和Vector NTI 软件完成。

2结果与分析2．1甘蔗几丁质酶基因cDNA全长获取以玉米chiI基因（Gene Id：AY532757．1）作为探针，经数据库比对搜索后，得到15条与之同源性较高的甘蔗EST序列。

借助DNAStar软件进行拼接，获得一个1236bp重叠群序列。

通过ORF Find-er软件预测，该序列具有完整的开放读码框（ORF 80bp－1069bp），具有起始密码子ATG和终止密码子TAG，故推测其为一条全长cDNA序列，命名为SCCHI1。

图1为该基因的拼接示意图，图2显示经电子克隆得到的序列信息。

图1甘蔗几丁质酶基因的cDNA序列拼接示意图Fig．1The joint map of chitinase cDNAsequence fromsugarcane图2电子克隆获得的SCCHI1基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列（*终止密码子）Fig．2Nucleotide acid sequence and deducedamino acid sequence of SCCHI1obtainedby in silico cloning（*stop codon）2．2SCCHI1基因编码氨基酸的一级结构分析经预测，甘蔗几丁质酶基因SCCHI1编码氨基酸的一级结构如表1所示。

表1SCCHI1的一级结构预测分析Table1Primary structure analysis of SCCHI1一级结构特性预测结果编码的氨基酸数/个329等电点（PI）6．83分子量（MW）/Da34128．2负电荷残基（Asp+Glu）/个21正电荷残基（Arg+Lys）/个21分子式C1493H2258N410O465S23不稳定系数（II）32．13平均疏水性（GRAVY）－0．170脂肪系数（AI）55．382．3SCCHI1蛋白信号肽预测与分析采用SignalP3．0Server预测SCCHI1的信号肽，结果如图3、表2。

由图3、表2可知，SCCHI1基323第4期苏亚春，等：甘蔗几丁质酶基因的电子克隆与生物信息学分析因的编码蛋白在氨基酸序列的20和21位置上有一个潜在的信号肽断裂位点，概率为0．965。

并且，C 最大值与Y 最高峰以及S 最高值处于同一区域，因此，SCCHI1含有信号肽，该蛋白的成熟肽链可能起始于22位，假定信号肽概率1．000。

该预测与前人文献报道的在几丁质酶N －端信号区由20多个氨基酸组成，可以引导几丁质酶运输到内质网，与酶的抑菌活性有关的特性一致［12］。

图3SCCHI1信号肽预测Fig.3Signal P －NN prediction for SCCHI1表2SCCHI1信号肽预测Table 1Signal P －NN prediction for SCCHI1指标（Measure ）位点（Site ）分值（Score ）有无信号肽（Signal peptide ？）max．C 210．901有max．Y 210．833有max．S130．994有注：C score ：原始剪切位点的分值；S score ：信号肽的分值；Y score ：综合剪切位点的分值图4SCCHI1氨基酸疏水性/亲水性的预测Fig．4Predicted hydrophobicity /hydrophilicity of thededuced amino acid sequence of SCCHI12．4SCCHI1蛋白疏水性/亲水性分析借助ProtScale 对SCCHI1基因编码的氨基酸序列的疏水性/亲水性进行预测（图4）。