南农 细胞生物学 7详解

第九章核糖体第一节核糖体的类型与结构核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确地合成多肽链。

1953年，Robinsin和Brown用电镜观察植物细胞时发现了这种颗粒结构。

1955年Palade在动物细胞中也观察到类似的结构。

1958年Roberts建议把这种颗粒结构命名为核糖核蛋白体(ribosome)，简称核蛋白体或核糖体。

核糖体几乎存在于一切细胞内，不论是原核细胞还是真核细胞，均含有大量的核糖体。

即使最小最简单的细胞支原体，也至少含有数以百计的核糖体。

线粒体和叶绿体中也含有核糖体。

目前，仅发现在哺乳动物成熟的红细胞等极个别高度分化的细胞内没有核糖体。

因此可以说核糖体是细胞最基本的不可缺少的结构。

核糖体是一种颗粒状的结构，没有被膜包裹，其直径为25 nm，主要成分是蛋白质与RNA。

核糖体RNA称为rRNA，蛋白质称r蛋白，蛋白质含量约占 40％，RNA约占60％。

r蛋白分子主要分布在核糖体的表面，而rRNA则位于内部，二者靠非共价键结合在一起。

在真核细胞中很多核糖体附着在内质网的膜表面，称为附着核糖体，它与内质网形成复合细胞器，即糙面内质网。

在原核细胞的质膜内侧也常有附着核糖体。

还有一些核糖体不附着在膜上，而呈游离状态，分布在细胞质基质内，称游离核糖体。

附着核糖体与游离核糖体所合成的蛋白质种类不同，但核糖体的结构与化学组成是完全相同的。

核糖体常常分布在细胞内蛋白质合成旺盛的区域，其数量与蛋白质合成程度有关。

处在指数生长期的细菌中，每个细胞内大约有数以万计的核糖体，其含量可达细胞干重的40％。

而在培养的饥饿状态的细胞内，仅有几百个核糖体。

在体外培养的HeLa细胞中，核糖体的数目约为5X106～1X107个。

从核糖体发现至今近50年的时间，对核糖体的结构、成分与功能的研究，积累了丰富的材料，特别是近几年对rRNA的研究取得了重要的进展。

精细的生物化学分析，分子生物学、免疫学及其与电子显微镜技术的配合是取得这些成果的重要实验基础。

一、核糖体的基本类型与成分生物有机体细胞内有两种基本类型的核糖体：一种是70S(S为Svedberg沉降系数单位)的核糖体，其相对分子质量为2 500X103，原核细胞的核糖体为 70S，真核细胞线粒体与叶绿体内的核糖体也近似于70S；另一种是80S的核糖体，相对分子质量为4 800X103，真核细胞的核糖体(除线粒体与叶绿体核糖体外)均为80S。

不论70S或80S的核糖体，均由大小不同的两个亚单位(sub— unit)构成(图9—1)。

体外实验表明70S的核糖体在Mg2’浓度小于1 mmol／L的溶液中，易离解为50S与30S的大小亚单位，当溶液中Mg2’浓度大于 10mmol／L时，两个核糖体常常形成100S的二聚体。

核糖体大小亚单位在细胞内常常游离于细胞质基质中，只有当小亚单位与mRNA结合后大亚单位才与小亚单位结合形成完整的核糖体。

肽链合成终止后，大小亚单位解离，又游离存在于细胞质基质中。

用EDTA、尿素和一价盐可逐级去掉核糖体上的r蛋白，最后得到纯化的 rRNA。

对核糖体的成分分析结果如表9—1所示，在原核细胞中50S与30S的大小亚单位的相对分子质量分别为1 600X103和900X103。

小亚单位中含有一个16S的rRNA 分子，相对分子质量为600 X 103，由1 542个核苷酸组成 (E．coli)。

大亚单位中含有一个23S的rRNA分子，其相对分子质量为1 200X 103，由2 904个核苷酸组成(E．coli)。

大亚单位还含有一个5S的rRNA，相对分子质量为30X103，仅由120个核苷酸组成(E．coli)。

从30S小亚单位中已发现有21种不同的蛋白质分子(称S蛋白)，50S大亚单位约含31种蛋白质(称L蛋白)。

在E．coli核糖体中除了L7／L12有4个拷贝，S6有2个拷贝外，其余的 r蛋白仅有一个拷贝。

80S的核糖体普遍存在于真核细胞内，对分离的核糖体进行理化性质测定，发现与原核细胞核糖体具有类似的特征。

随着溶液中Mg2’浓度的降低，80S的核糖体可离解为60S与40S的大小亚单位，当Mg2’浓度增高时，80S的核糖体又可形成120S的二聚体。

对80S核糖体的成分分析结果如表9—1所示， 60S与40S亚单位的相对分子质量分别为3 200X103与1 600X103。

小亚单位中含有一个18S的rRNA分子，相对分子质量为900X103。

大亚单位中含有一个28S的rRNA 分子，相对分子质量为1 600X103，还含有一个5S的rRNA分子和一个5．8S的rRNA分子。

在不同的真核细胞中，核糖体也存在着差异，如动物细胞核糖体的大亚单位内有28S rRNA，而植物细胞、真菌细胞与原生动物细胞内，核糖体的大亚单位中却不是28S rRNA，而是25～26S rRNA；在低等真核生物细胞中，构成核糖体的rRNA类型比较复杂，可能不仅限于以上几种。

真核生物核糖体的小亚单位约含33种蛋白，大亚单位约含49种蛋白(表9—1)。

表9—1 原核生物与真核生物核糖体成分的比较(引自Lewin，1997)rRNA中的某些核苷酸残基被甲基化修饰，甲基化常发生在rRNA序列较为保守的区域。

如16S rRNA 3，端高度保守序列中二个相邻的腺嘌呤核苷酸中的4个甲基化位点G—m6A—m6A，它可能参与30S和50S的亚单位的结合过程。

16SrRNA一般有10个甲基化位点，23SrRNA约有20个甲基化位点。

在哺乳动物核糖体的18SrRNA和28SrRNA中，其甲基化位点分别为43个和74个，约占全部核苷酸总数的2％，远高于原核细胞的rRNA。

二、核糖体的结构用离子交换树脂可分离纯化各种r蛋白。

将纯化的r蛋白与纯化的rRNA进行核糖体的重装配，可进一步显示核糖体中r蛋白与rRNA的结构关系(图9—2)。

在重装配过程中，某些蛋白质必须首先结合到rRNA上，其他蛋白才能装配上去，即表现出先后层次。

这种关系，在很大程度上可能也反映核糖体在体内装配的情况。

核糖体的重装配不需要其他大分子的参与，是一个自我装配的过程。

用双向电泳技术可显示出E．coli核糖体在装配各阶段中，与rRNA结合的蛋白质的类型。

这一技术广泛地用于分析各种核糖体的亚单位及其装配中的亚图9—2 为了进一步研究r蛋白在结构上的相互关系，常使用双功能的交联剂(di functional cross—linking agent)，利用交联剂分子中两个活泼的基团分别与蛋白质中某些基团共价结合，结果像订书钉一样，把核糖体中相邻的蛋白质分子共价结合在一起，再经双向电泳分离后，便可测出r蛋白之间的空间关系。

H．G．Wittman纯化了E．coli核糖体中的52种蛋白质，并测出其一级结构，发现除L7和L12两种蛋白具有相同的氨基酸序列(所不同的是L7在N端有一个酰基)外，几乎所有蛋白的一级结构都有很大不同，因而在免疫学上也几乎没有同源性。

进而将纯化的E．coli的各种r蛋白制成抗体，发现从不同原核生物中分离的r蛋白之间有很高的同源性，序列分析也证实了这一点，说明在不同物种的细胞中，核糖体可能来源于一个共同的祖先，并在进化上是非常保守的，甚至在E．coli与植物叶绿体中的r蛋白也有很高的同源性。

同样，在不同的真核生物中，r蛋白之间也普遍存在很高的同源性，甚至在E．coli与大鼠的某些r蛋白之间也显示出很强的免疫交叉反应。

上述工作为进一步分析某一种r蛋白的哪一结构域与另一种r蛋白或与rRNA的结合打下了基础。

最直观的方法是，电镜负染色与免疫标记技术结合起来，研究r蛋白在核糖体的亚单位上的定位。

抗体分子具有两个抗原的结合位点，将抗某一种r蛋白的抗体加入纯化的核糖体亚单位中后，两个亚单位就会被同一个抗体分子在相同的部位上交联在一起，与未加抗体的核糖体亚单位的电镜图片进行比较，便可知道抗原决定簇，即该种 r蛋白在亚单位上的位置。

目前已了解E．coli核糖体的几乎全部r蛋白的分布及其相互关系(图9—3)。

对rRNA，特别是对16S rRNA结构的研究已积累了丰富的资料。

通过对 500多种不同生物的rRNA序列的分析，发现其一级结构是非常保守的，某些序列是完全一致的。

16SrRNA的二级结构具有更高的保守性，尽管不同种的 rRNA的一级结构可能有所不同，但它们都折叠成相似的二级结构——即由多个臂环(stem —loop structure)所组成的结构(图9—4)。

其中不到半数的碱基配对，且双螺旋区(臂)一般小于8 bp，而未配对的碱基形成环。

整个16SrRNA可分成4个结构域即中心结构域(centraldomain)、5’端结构域(5’domain)、3`主结构域(3’major domain)及其与中心结构域之间的主结构域(major domain)(图9—3)。

rRNA与r 蛋白之间的结构关系，可用多种技术来研究。

如根据与蛋白结合的rRNA的某一区域往往更能耐受核酸酶的水解，可用RNA酶温和地水解核糖体，经分离后，分析被保护的核苷酸序列及与之相结合的蛋白质成分。

此外还可用交联剂将结合在rRNA上的蛋白与结合位点处的rRNA碱基共价交联后，进一步做序列分析，用这些方法发现位于核糖体A位点的tRNA和位于P位点的tRNA与16S rRNA的结合部位，这些部位都处在16SrRNA的高度保守序列上。

通过中子衍射技术(neutrondiffraction)分析可获得rRNA臂环结构的三级结构模型，再根据与蛋白质结合的rRNA序列以及蛋白质与蛋白质之间的关系，提出70S核糖体的小亚单位中rRNA与全部r蛋白关系的空间模型。

图9—4 核糖体小亚单位rRNA的二级结构以上技术已用于对50S亚单位的分析，并已取得了一些重要的进展。

近年发现，蛋白质合成进程中很多重要步骤与核糖体50S大亚单位相关，如：(1)依赖延伸因子Tu(EF—Tu)的氨酰tRNA的结合；(2)延伸因子G(EF—G)介导的转位作用；(3)依赖于起始因子2的fMet—tRNA的结合；(4)依赖于释放因子的蛋白合成终止作用；(5)应急因子(stringent factor，在营养缺乏条件下因子)与核糖体结合产生ppGpp(p)阻断蛋白合成等。

促代谢水平迅速下降的上述过程中的多数因子为G蛋白，具有GTPase活性，故将核糖体上与之相关位点称为GTPase相关位点。

应用遗传突变株、化学交联和RNA与蛋白结合的足迹法等技术证明，在核糖体50S大亚单位上GTPase相关位点主要涉及二部分：(1)核糖体蛋白Lll和rRNA复合物(E．coli中为23S rRNA的1 030— 1 125核苷酸片段)和L10(L12)：形成的五聚体，其中两个L12二聚体(N端结构域相结合)通过L10结合在rRNA片段上且与L11毗邻，L12二聚体形成50S大亚单位的突起部分，其C端可相对运动。