第5章 生产菌种的制备与保藏

第5章生产菌种的制备与保藏
本节课的重点
1、种子制备过程
2、种子质量的控制措施
本节课的难点
影响种子质量的因素
第一节生产菌种的制备过程
种子扩大培养的概念
发酵工业生产过程中的种子必须满足的条件
1) 菌体的纯种培养物总量适宜，以保证在发酵罐中有适当的接种量；
2）微生物菌种的生命力旺盛，移接到发酵罐中后能够迅速生长，利于缩短延滞期，提高设备的利用率；
3）菌种能保持稳定的生产性能，生理状态稳定；
4）无杂菌和噬菌体的污染。

种子扩大培养任务：要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。

对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。

抗生素类产品的生产采用放线菌，一般采用三级或四级种子扩大培养；谷氨酸等氨基酸产品，以及部分酶制剂类产品生产，采用细菌，采用二级种子扩大培养。

一、菌种扩大培养的目的
1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。

目的就是：a、缩短发酵周期
降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）
b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。

从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌，抑制杂菌生长除了严格环境以外，在数量上让培养菌占绝对优势也是一种方法，往往是一种行之有效的方法。

例如：啤酒的发酵……
2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应，
例如：啤酒发酵
3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。

许多生产菌种往往都是“溶原性”的？
通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了生产的可靠性。

二、扩大培养的方法
通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业，有霉菌
的纯培养，也有混合培养如：大曲
液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业
1.液体扩培流程
固体试管三角瓶大三角瓶一级种子二级种子
三级种子
发酵罐
2.固体扩培流程
固体试管三角瓶种曲麸曲（机械通风制曲）
两者的优缺点比较：
固体培养
（1）酶活力高。

（因为菌丝体密度大）
（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。

（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。

缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。

（2）周期长。

（3）培养过程中环境条件控制较难。

（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。

液体培养
（1）生产效率高，便于自动化管理。

（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。

（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。

缺点：
（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。

（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。

现代生物技术的发展是以基因工程菌为主导的微生物发酵领域，其菌种的培养要求无菌程度高，而且培养过程中的条件要求也非常严格（否则易发生变异导致质粒丢失），从这种意义上讲，固体菌种的制备是难以实现的，因此，应以液体培养为主导方式。

应该指出的是：
随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了产业化。

例如：酒精的生产
原生产工艺流程为：……
其中以酵母为线条的生产工艺为：
以霉菌为线条的生产工艺为：
现在：（1）酵母使用粉末酵母鲜压榨酵母固定化酵母细胞
（2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代
三、菌种扩大培养的条件：
菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。

但是，与发酵工艺却有着很大的差别。

1.培养基：
种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。

例如：啤酒酵母扩大培养用的培养基组成如下：
固体试管液体试管三角瓶大三角
（无酒花）（有酒花）（有酒花）
汉逊罐
通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。

例如：HASS（高温淀粉酶）
三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖
3m3种子罐：液化淀粉
2.温度
种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。

例如：啤酒酵母扩大培养
固体液体三角瓶大三角瓶汉逊罐
28℃ 25℃ 20℃ 15℃ 10-15℃
需要指出的是：
（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度为32-34℃
（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以
缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。

3.氧的供给
菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖
速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应
提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。

足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等，后述。

4.pH值
菌种扩大培养的pH值很重要，直接影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：
（1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往往与发酵最适pH值不同。

（2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5——1.0个单位，因此，……
（三角瓶灭菌后，不能够调整pH值，不宜无菌操作）
第二节生产菌种的质量保证
1、种子质量的判定
（1）pH；
（2）培养基灭菌后糖、氨基酸、磷等的含量；
（3）显微镜下观察菌丝形态、菌丝浓度和培养液的外观色泽和颗粒等；
（4）其他参数，主要酶活力、产品含量等。

2、影响种子质量的因素
（1）培养基
（2）培养温度和湿度
（3）培养时间(种龄)
（4）接种量
（5）通气和搅拌
（6）泡沫
（7）染菌的控制
（8）种子罐级数
3、种子异常的分析
（1）菌种生长发育缓慢或过快
（2）菌丝结团
（3）菌丝粘壁
4、种子质量的控制措施
（1）菌种稳定性的检查
方法：将保藏菌株溶于无菌的生埋盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。

这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。

（2）无杂菌检查
在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。

方法：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。

此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、pH 变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等。

5、种子质量标准
（1）细胞或菌体（菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观）
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。

霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。

（2）生化指标：种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化
（3）产物生成量：在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。

（4）酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定关系。

第三节生产菌种的保藏
一、菌种保藏的目的和意义
目的意义：保持优良菌种优良性状的稳定，满足生产的实际需要。

优良菌种丢失（退化）的原因：世代短、易变异、易污染、死亡。

菌种保藏机构：世界现有700多家专门机构。

措施：创造条件，使微生物处于休眠状态，减少变异。

低营养、低温、干燥、缺氧→低代谢、低生长
二、菌种保藏的原理和方法
1. 菌种保藏(Culture conservation)原理
A 挑选优良的菌种，最好是休眠体
B 创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）
2.菌种保藏方法
1）斜面(Slant)低温保藏法传代培养，六个月
2）砂土管保藏适用范围广，两年
3）冷冻干燥(Freez-drying)保藏法长达十年
4）液氮超低温保藏法（-130℃）
(Liquid nitrogen ultra-low temperature storage)
思考题
1、名词解释
多因素低剂量的诱变效应、互变异构效应、染色体畸变、基因突变、表型延迟、营养缺陷型、杂交育种、原生质体融合、原生质体再生、菌种的扩培、接种量、菌种退化、菌种复壮
2、采集土壤微生物样品时应该注意哪些问题？
3、什么是增殖培养？为什么要进行增殖培养？
4、土壤中分离纯化微生物的方法有哪些？请简述之。

5、什么是微生物的初筛？请例举两种初筛方法，并简述之。

6、菌种保藏的原理是什么？常见的军种保藏方法有哪些？
7、菌种退化的原因有哪些？简述防止菌种退化的措施。

8、常见的菌种复壮措施有哪些？。