NO减少含有CX37的缝隙连接对小分子的渗透性

细胞生理学203:233-242学报（2005年）NO减少含有CX37的缝隙连接对小分子的渗透性PETRA KAMERITSCH,* NATASCHA KHANDOGA, WOLFRAM NAGEL, CHRISTINA HUNDHAUSEN, DARCY LIDINGTON, AND ULRICH POHL生理研究所，路德维希- 马克西米利安- 慕尼黑大学，慕尼黑，德国，Schillerstr合同授予赞助商：弗里德里希鲍尔基金会，慕尼黑。

*通讯作者：佩特拉Kameritsch，生理学研究所，慕尼黑路德维希- 马克西米利安大学，Schillerstr，44，80336慕尼黑，德国。

电子邮件：Petra.Kameritsch @ lrz.uni - muenchen.de2004年6月1日，接受2004年8月作者：10.1002/jcp.20218 9缝隙连接间通讯（GJIC）在血管系统的有一个显著作用。

GJIC的规例是一个动态的过程，连接蛋白（CX）在蛋白表达和翻译后的修改有助于机制的改变。

我们假设内皮细胞的局部激素一氮氧化(NO)将减少在人的脐静脉内皮细胞的细胞(HUVECs)的染料联结。

在我们的随后实验，我们试图有针对性的通过激活或不激活NO信号转导通路隔绝具体的Cx异构体. 由于脐静脉内皮细胞细胞可变表达三个CX（Cx37，Cx40和Cx43），后者的目标，需要使用转染的HeLa细胞（HeLaCx37，HeLaCx43），CX蛋白表达野生型形式。

染料耦合成单细胞注射荧光染料（如的Alexa Fluor 488），并确定染色相邻细胞的数量。

人脐静脉内皮细胞NO供体SNAP（2毫米，20分钟）的应用减少30％的染料耦合。

在HeLa细胞中，SNAP没有减少细胞表达Cx43的染料转移，但下降的染料转移Cx37 76％的细胞表达Cx43蛋白的表达。

SNAP对染料耦合效果是不通过的cGMP介导的。

相比之下及其对染料耦合的影响, SNAP没有电耦合效应，测量由双膜片钳全细胞模式。

我们的研究结果表明，NO抑制对Cx37的具体影响的小分子间的转移，表明了NO在控制血管细胞间隙连接通讯的某些方面的起潜在作用。

生理学细胞研究203：233-242，2005年。

2004年威利- LISS缝隙连接间通讯（GJIC）在血管系统有一个显著作用。

作为例子，细胞间隙连接通讯的内皮细胞和/或平滑肌细胞允许(i) 快速电紧张传导电信号沿血管树（西格尔，1994; Pacicca等，1996）之间传导，允许协调在一个微血管网络段的顺序分支的变化(Segal et al., 1989; Frame and Sarelius, 1993; Segal, 1994); (ii) 从“起搏细胞”，在肺毛细血管内皮细胞短距离内传播缓慢的钙波英等。

及（iii）为扩张血管床nonparacrine （paragrine 释义n. [生理] 旁分泌；副分泌；旁泌性）机制，指定为“内皮源性超极化因子（EDHF）”（哈奇森等人，1999年，多拉等人，2003年）。

在一些病理过程，如动脉粥样硬化（郭某等人，2002年）和高血压，改变细胞间隙连接通讯已被观察到（威特等，2003年），并可能在其发展中有致病作用。

缝隙连接是由小的（26-50 kDa的），高度保守的不可或缺的蛋白，被称为连接蛋白（CX）。

在哺乳动物中，至少18个不同的CX的亚型已经确定（柴田等人，2001年），与目前的命名区分他们基于其分子量。

四种CX 亚型已经确定在血管组织，虽然他们表达的整个血管树有差异。

内皮细胞表达的CX亚型Cx37，Cx40，Cx43的（卢等，2002;。

Rummery等，2002），而平滑肌细胞的表达Cx37，Cx40，Cx43的，和Cx45（Hu和Cotgreave，1997年;关小室，2001年，服务器等，2001; Rummery等，2002; Haefliger等人，2004年）。

众多血管组织中表达的CX异构体，具有独特的生物物理特性，意味着一个高度专业化的功能。

事实上，有针对性的具体CX亚型的缺失导致在小鼠体内的血管功能独特的变化：(i) Cx40的去除是与高血压和不规则的小动脉的血管收缩相关（威特等人，2003年。

）; （二）特定的内皮细胞间隙连接蛋白Cx43的缺失导致低血压和心动过缓（廖等，2001）; 及（iii）在组织的一个子集完成去除Cx40和Cx37，Cx43蛋白或同时去除是不可行的，这是由于在此组织严重的的心血管异常，（西蒙和McWhorter，2002年）。

一些实验模型，也突出了具体CX血管细胞亚型的重要性。

例如，创面修复与改变Cx37和Cx43的表达(Kwak et al., 2001).。

细胞间缝隙通讯链接不是静电现象，通过规律的蛋白表达。

在细胞膜镶嵌入缝隙连接蛋白，翻译后修饰（如：磷酸化作用）细胞缝隙连接通讯能够被加强或者限制。

而且，由于个别CX具有独特的渗透性能在CX的缝隙连接通道复合物的改变能很大程度的影响细胞缝隙连接通讯.由于缝隙连接通透性的调节对于血管系统的生理功能是至关重要的，关键是识别控制CX表达和GJ通透性的内源性调制。

一个潜在的内源性血管GJS调制器是一氧化氮（NO），是主要来自血管内皮细胞。

据报道，NO可以减少各种非血管细胞类型的细胞间隙连接通讯和CX表达（博拉尼奥斯和麦地那，1996年，卢和麦克马洪，1997年）。

相比之下，我们的实验室已经证明，没有增加新的人脐静脉细胞的缝隙连接Cx40表达（内皮细胞）（Hoffmann 等，2003）也没有（发现）通过缝隙连接的CX急性影响染料耦合（Kameritsch等，2003）。

本次调查的重点是，确定是否有没有从脐静脉内皮细胞分离培养的内皮细胞间隙连接通讯在变更导致的外源性的应用程序。

如前面所述，我们推测，在神经细胞急性暴露NO会减少染料耦合介导Cx37或Cx43的效果（博拉尼奥斯和麦地那，1996年）。

我们的后续实验试图孤立具体CX异构体没有或没有激活的信号通路调节。

可改变由于脐静脉内皮细胞细胞表达三个CXS（Cx37，Cx40和Cx43），后者的目的，需要使用的HeLa细胞，不表达CX蛋白。

虽然CX亚型实际上组成肌内皮缝隙连接确凿的证据仍然是难以捉摸的，Cx37推测内皮细胞和平滑肌细胞之间形成异型路口（即，Cx40，Cx43的，或Cx45）。

因此，我们集中在这CX蛋白，与第二个假设，NO调解染料耦合，通过一个Cx37依赖机制（观察）其效果。

（HU和Cotgreave，1997年，希尔等人，2002年）。

材料与方法细胞培养对JAFFE（1973年）脐静脉内皮细胞制备的描述稍作修改。

.总之，内皮细胞，收获孵化和随后刚获得的人脐静脉灌注Mg2þ和Ca2þ磷酸盐缓冲液（PBS）含dispase（2.4 U /毫升，勃林格殷格翰公司，德国）。

分离后的细胞接种到24孔板（格雷纳，Frickenhausen，德国），分别保持在介质199（pH值7.4;，Taufkirchen 的Sigma公司，德国），辅以20％小牛血清（Biochrom，柏林，德国），100 U / ml青霉素（Genaxxon，Stafflingen，德国），100毫克/毫升链霉素（Genaxxon）与血管内皮生长介质取代3:1稀释。

均保持在378C和5％CO2，将细胞放在玻璃盖玻片上与胶原预涂前一次或两次传代培养他们，。

一旦他们达到汇合，然后用于实验，。

HeLa细胞，野生型和CX -转染，来自克劳斯Willecke博士（德国波恩大学）的礼物。

细胞培养在378C的玻璃盖玻片上，5％CO2，10％的DMEM与新出生的小牛血清，青霉素（50 U/ml/0.006％W / V），链霉素（辅以50 mg/ml/0.013 W / V ），嘌呤（1毫克/毫升，Sigma公司）。

检测（发现）野生型HeLa细胞不表达CX蛋白，无论是（鼠标）Cx37或Cx43的（鼠）是在这些细胞中表现出稳定的转染（Elfgang等，1995）。

实验开始前，盖玻片进行培养的单层细胞（人脐静脉内皮细胞或HeLa细胞）被安装在一个定制室在激烈的显微镜阶段。

细胞在378C一个HEPES缓冲盐溶液中预孵育15分钟（125 mMNaCl，3 mMKCl，1.25MM磷酸二氢钠，2.5mMCaCl2，1.5mMMgCl，10mMGlucose，10mMHEPES，pH值7.4）次缓冲液含无- 硝基- L -精氨酸（低噪声放大器（LNA），30毫米，罗氏，Penzberg，德国）和超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶，50 - 500 U / ml时，罗氏公司），以抑制内源性NO的形成和清除超氧阴离子。

Cx37和Cx43细胞的共同培养对于Cx37和Cx43转染的HeLa细胞共培养的实验，Cx37转染的细胞标记的红色荧光染料PKH26（Sigma公司）。

细胞与PKH（3mMin PBS）在室温习共同培养5分钟，随后用PBS洗3次。

紧随染色过程控制在试点实验的细胞标记。

在所有情况下，100％新鲜trypsinised细胞和第一个子代细胞PKH荧光（法¼543纳米，LEM 570纳米）呈阳性。

Cx37转染新鲜trypsinised的PKH标记的HeLa细胞和没有标记的在1:10的比例混合。

混合细胞被镀上玻璃盖玻片共同培养过夜。

共同培养的细胞在15-30小时内耦合实验使用。

染料耦合使用染料填充的高硼硅微管（在80毫米汞柱尖端直径小于1毫米的一角按压0.5秒，）注射系统连接到一个单细胞注入荧光染料染料（3.5毫米的Alexa Fluor 488，钙黄绿素1毫米，1毫米羧基荧光分子探针，莱顿，荷兰;在150毫米氯化钾溶解）通过缝隙连接的耦合进行分析（Femtojet，Eppendorf 公司，汉堡，德国）。

供应商表示被激发的荧光染料在他们的最佳激发波长使用长传排放过滤器（LEM 515纳米）检测荧光信号。

染料注射后，使用数码相机抓拍(Imago, Till photonics, Grafelfing, Germany)的是安装在倒置显微镜下，并存储在计算机上离线分析使用的图像。

在一些实验结合的Eppendorf喷射系统（Transjector 5246），共聚焦显微镜（LSM410，Zeiss）使用。

在血管内皮细胞单层，最终放大倍率200X（640 640毫米）的实验中使用，而在最后的400（显示面积约320 ×240毫米）的放大倍率分析HeLa细胞。

为了评估融合的人脐静脉内皮细胞单层细胞耦合，染料染色的细胞在10分钟引入后的时间点的总数进行计数。

由于HeLa细胞单层细胞之前达到完全合流，在可视化领域蜂窝耦合衡量计算在注射后12分钟的时间点（染料染色的细胞恢复正常细胞总数）的染料染色细胞的百分比。