猪苓菌培养特性研究进展

猪苓菌培养特性研究进展
摘要阐述了猪苓菌的形态结构、适生条件、营养特性、培养基配方、适生树种及猪苓菌与伴生菌、蜜环菌的相互关系和诱导猪苓菌丝扭结形成菌核的相关因子,以期为猪苓菌的深入研究和人工栽培提供参考。

关键词猪苓菌;培养特性;伴生菌;蜜环菌;菌核形成
猪苓菌(Dendropolyporus umbellatus(Pers.)Jülich),别名猪苓花、猪灵芝,于实体丛生,肉质鲜美,其地下的菌核即为猪苓,是传统的真菌药物之一,在我国已有2 000多年的药用历史。

现代医学证明,猪苓具有消炎、利尿、渗湿、通淋、退肿、降压、轻身耐老、抗癌、抗辐射等功能,临床上可治尿路结石、黄疸、急性肾炎、暑热水泻、全身水肿、心源性水肿、腹泻、尿急、尿频、尿道痛、肝硬化、腹水、乙型肝炎。

猪苓多糖制剂对肺癌、肝癌、食道癌、宫颈癌及白血病均有较好的临床效果。

随着我国医疗事业的发展,以猪苓为原料的成品药必将得到进一步开发,探索人工栽培的新途径必然会倍受关注。

该文就猪苓菌的培养特性进行了阐述,以期为猪苓菌的深入研究及人工栽培提供有价值的参考。

1菌丝的培养特性
1.1菌落与菌丝形态结构
猪苓菌的分离一般可采用子实体、菌核组织分离和孢子分离。

PDA、CPDA 或GYA(葡萄糖-酵母粉-琼脂粉)可作为分离或母种培养基[1-3]。

在PDA上,猪苓菌落呈圆形,菌丝白色,絮状,气生菌丝发达。

在平板或斜面培养基上均具有较强的爬壁能力。

猪苓菌色素的形成受培养基中添加的成分(如单双糖、糖醇及酪氨酸)、温度、pH值和光照等因素的影响。

猪苓菌丝细胞狭长,多分枝,细胞壁较薄,直径在0.95～4.50μm[2,4]之间,生殖菌丝上锁状联合突起结构明显,顶端有膨大。

平行菌丝间常有长短不一的H型横向菌丝融合桥,进而形成菌丝网络。

众多菌丝纠结或合并可形成直径10.0μm以上的菌索或大小为14.0～16.0μm×12.0～15.0μm的拟菌核结构。

培养过程中气生菌丝可断裂形成节孢子或顶端单生或2～3个并生,椭球形,大小为 3.0～16.0 μm×2.5～6.5 μm的厚垣孢子。

显微观察,在猪苓菌丝间散布有形状规则、晶形完整的八面体或双锥形草酸钙结晶。

用高碘酸-Schiff试剂染色老化菌丝,在老化菌丝胞壁上或老化菌丝断裂处富积有大量能被染成淡红色、圆粒状的次生代谢多糖
结晶[5]。

1.2温度、光照和pH值对猪苓菌生长的影响
猪苓菌丝在5～35℃[6-8]范围内均可生长,当温度低于15～18℃时,菌丝生长速度减慢,长势一般,菌丝褐变缓慢或暂无褐变。

当温度高于28～30℃时,菌丝生长速度也出现减慢,长势变差,并易出现老化变褐[9,10]。

在5℃以下或35℃以上,菌丝生长几乎停滞。

猪苓菌丝生长的适宜温度为24±4℃,最适温度为25℃[4,8]。

在黑暗和光照条件下,猪苓菌丝均可生长。

但在全黑暗下菌丝生长快、长势好;全光照或12h光暗交替,菌丝生长较慢,且易出现褐变老化[6,8]。

有试验表明,每天给猪苓菌丝2～3h的4℃低温处理,有利于诱导其菌核的产生。

一定温差(10℃)的变温处理和暗培养,可诱导猪苓菌丝直接分化子实体原基[6,8]。

一般而言,多数真菌都适宜在偏酸性环境中生长[11]。

猪苓菌丝可以在pH值为3.5～9.0的环境下生长[4,8],但以中性偏酸(pH值4.0～7.0)的条件比较适合,pH 值低于4.0或高于8.0的菌丝生长慢、长势差,易出现菌丝褐化[6-8,10]。

1.3菌丝生长的营养特性
1.3.1对碳源的利用。

猪苓菌对碳源有较为宽泛的适应性。

葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糖醇、低聚异麦芽糖、甘露糖、甘露醇、低聚甘露糖、木糖、木糖醇、低聚木糖、淀粉、糊精、甘油、山梨醇、乙醇、羧甲基纤维素等都可以作为猪苓菌丝生长的碳源。

其中麦芽糖、甘油、山梨醇、麦芽糖醇、低聚异麦芽糖作碳源菌丝生长速度快,气生菌丝发达,菌丝丛疏;淀粉、乙醇、半乳糖、木糖、木糖醇、低聚木糖作碳源菌丝生长速度虽然较慢,但气生菌丝极发达,菌丝丛厚,尤其是木糖醇和木糖为碳源时,气生菌丝最发达,菌丝丛最厚。

葡萄糖、蔗糖、甘露糖、糊精、甘露醇、低聚甘露糖等作碳源菌丝生长速度较快,气生菌丝发达,但老化快;果糖作碳源菌丝生长速度较快,气生菌丝易组织化呈肉皮状[10,11];猪苓菌对羧甲基纤维素的利用率较低[12]。

1.3.2对氮源的利用。

有机氮源(动物性、植物性和微生物性)比无机氮源更适合猪苓菌菌丝生长。

在有机氮源中,猪苓菌丝生长速率和长势依次为:酵母膏>黄豆粉>玉米糠>蛋白胨>麸皮粉[13];在无机氮源中,猪苓菌丝生长速率和长势依次为:硝酸钠>硫酸铵>尿素[10]。

猪苓菌在含尿素的培养基上,虽然径向生长缓慢,但尿素能在一定的使用浓度范围内随浓度的升高较早地促使菌丝扭结形成幼小的白色拟核,并渐变成类似于猪苓菌核表面有油漆光泽的灰黑色拟核。

菌丝拟核化的立体生长自然会影响菌落的平面径向生长[14]。

碳氮比对猪苓菌丝生长速度有明显的影响,但对菌丝长势影响不明显。

猪苓菌丝在碳氮比10～100∶1的范围内均可生长,但适宜的碳氮比为40～70∶1之间,最佳碳氮比为50∶1[13]。

1.3.3无机盐对猪苓菌生长的影响。

无机盐是猪苓菌生命活动中不可缺少的营养物质,它们不仅具有调节渗透压、氢离子浓度、氧化还原点位的作用,还是菌体的结构、酶或辅酶的组成成分,有维持酶活的功能。

无机盐的使用因培养菌种类、培养基质类型及培养方式的不同,使用剂量、作用效果也会不同,需灵活掌握。

如硝酸钠(NaNO3)、柠檬酸三铵[(NH4)3C6H5O7]、磷酸氢二钾(K2HPO4)、硫酸镁(MgSO4)、硫酸铵[(NH4)2SO4],按0.1%的添加量分别加入GPC(葡萄糖蛋白胨玉米浆)培养基中,硝酸钠对猪苓菌丝生长有明显促生作用,磷酸氢二钾和硫酸铵、硫酸镁作用效果不明显,柠檬酸三铵和硫酸镁对猪苓菌丝生长不利[10]。

磷酸二氢钠(NaH2PO4)、硫酸钾(K2SO4)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)分别添加到相应PDA培养基中,各无机盐菌对猪苓菌丝生长有利,尤以P、Cu、Zn 的促生作用更为明显。

各无机盐的适宜添加量分别为:NaH2PO4 0.090g/L、K2SO4
2.000g/L、CuSO4·5H2O 0.012～0.024g/L、ZnSO4·7H2O 0.024～0.030 g/L[14]。

1.3.4其他添加物对猪苓菌生长的影响。

在培养基中适量添加非生物物质和生物类培养液,如活性白土、硅藻土、高岭土、猪苓伴生菌水提取物、蜜环菌水提取物、假单胞杆菌(Pseudomonas alba Migula)发酵液、灵芝[Ganoderma lucidum(Legss.ex Fr.)Karst]发酵液及金针菇[Flammulina velutipes(Fr.)Sing] 发酵液等均有良好的促生作用[10,15]。

2培养基配方对猪苓菌丝生长的影响。