基因扩增检验标本的处理保存及核酸提取方法.

• 同上，重复洗涤一次 • 弃上清，沉淀即可用于DNA提取
• 5．体液 • 体液标本，包括胸水、腹水、脑 脊液、尿液等，可直接离心，取 沉淀物提取核酸。 • 血性胸腹水，可使用红细胞裂解 液处理：
• 加等体积红细胞裂解液，震荡混 匀，置5-10分钟
10000rpm，离心5分钟，弃上 清
可根据情况重复2-3次，沉淀物 用于DNA提取
具体方法：
• 用无菌平皿取患者肺深部咳出的痰液1-3ml， • 加入4倍体积4%NaOH，摇匀，室温下放置30 分钟左右液化 • 取1.5ml EP管，加0.5ml 液化痰液，再加0.5ml 4%NaOH室温放10分钟 •
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• •
12000 rpm，离心15分钟 弃上清，加无菌生理盐水1 ml ，混匀， 12000rpm离心5分钟 弃上清，沉淀物用于 DNA提取
• 组织 • 新鲜组织最好保存于50%乙醇中， 具体方法：先用生理盐水将组织洗 一次，切成小块，加入适量生理盐 水，然后边摇边加入无水乙醇至终 浓度为50%，这样固定的组织标本 室温下可保存数日，4oC可保存6 年。
• 总而言之，标本的保存及适 当的预处理对核酸模板的成 功提取具有决定性作用。要 强调的是，所有用于上述处 理的容器如试管或离心管， 均应在使用前压灭菌。
• 实验中，如接触了“脏的”玻璃 器皿和其他物品以后，手套就可 能污染RNase，因此RNA提取 实验中，应勤换手套。
• RN A提取方法
• 下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提 取法介绍RNA的提取。 • 异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质 变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致 细胞结构破碎，核蛋白由于其二级 结构的破坏消失而迅速与核酸分离。
• 棉拭子 • 用PCR方法检测性病病原体时（衣 原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋 体、人乳头状瘤病毒等），临床标 本一般为棉拭子。标本取材是关键， 衣原体等病原体感染上皮细胞，因 此取材一定要取到细胞。
具体方法：
• 加1ml无菌生理盐水，充分震荡混 匀，12000rpm ，离心5分钟 • 用棉拭子取尿道分泌物或宫颈分 泌物（由医护人员采集），置无 菌试管或EP管内 • 弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml， 打匀，12000rpm，离心5分钟
基因扩增检验标本的处理 保存及核酸提取方法
江西省临床检验中心
•
应用聚合酶链反应（PCR）技 术测定临床标本中的病原体核 酸成分，是一种高度敏感，且 最为直接的检测手段。由于临 床标本中含有蛋白质、脂类等 物质，可干扰PCR反应，故在 做PCR反应前必须进行核酸提 取。
• 经典的核酸提取方法通常是加去 污剂（SDS等）裂解细胞，经蛋 白酶处理、有机溶剂提取及乙醇 沉淀等步骤。
• 加50µl NaAc，500µl饱和酚：氯仿： 异戊醇（50：49：1），充分混匀， 冰浴10分钟
• 4oC12000rpm，离心5分钟 • 小心吸取上层水相移至一新离心管 中，避免吸取两相之间的蛋白质， 用氯仿-异戊醇再抽提一次
• 加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟 • 4oC12000rpm，离心10分钟 • 弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65oC 烘干 • 用10µl DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin • -20oC保存备用
• 全血标本 • 全血标本如用于DNA提取，可4oC 下短期保存（数天），时间长易降 解，如用于RNA检测，应在取血 后尽快提取RNA。 • 最好将DNA或RNA提取后，置70oC保存。
• 痰 • 液化的痰标本如不立即用于核 酸提取，可保存于-20oC。 • 处理后的棉拭子、体液、脓液 如不立即用于核酸提取，可保 存于-20oC。
• 由于样本的处理及保存对DNA 和RNA（尤其是RNA）的影响 较大，因此在核酸测定时标本的 处理及适当保存对测定结果的准 确有效非常重要。
• 临床常见的标本有血清（浆）、 全血、分泌物、棉拭子、脓液、 体液、新鲜组织、石蜡切片等， 这些临床标本的处理和保存方法 各有不同。
临床标本的处理
• 血清（浆）标本
• TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出 的产品，其操作方法简单方便，一小时 内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞， 再加入氯仿，离心后可见三层，上层为 透明的水相含有RNA，中间层含DNA， 下层为红色的有机相，含蛋白质。
• 3.旋转离心柱提取
• 旋转离心柱技术是用于微量核酸分 离纯化的较为简单的方法，属于硅 吸附方法的一种，市场上的离心柱 虽各有特色，但在原理上通常可分 为三个部分： – 利用裂解液促使细胞破碎，使细 胞中的核酸释放出来。
• 石蜡切片用于核酸提取，需先用 二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化 后进行DNA提取。
标本的保存
• 血清（浆）
• HBV：分离出的血清（浆）如不立 即提取核酸，保存于-20oC待检。 • HCV：尽快分离血清(浆), 如不立 即提取RNA， 保存于-20oC待检。
• 长期保存：吸取200µl血清，加 20u RNasin（RNA酶抑制剂）， 保存于-70C。 • 已发出结果报告的标本应及时转 移至冰箱保存，并由专人负责管 理，保存1-2周（时间长短根据 报告单上的承诺而定）。
• 所需溶液的配制：必须用高压 灭菌的水和RNA提取专用的化 学试剂配制溶液，用干烤过的药 匙称取试剂，把溶液装入无 RNase的玻璃器皿。
• 严格来说，所有溶液均应用 0.1%DEPC于37oC处理12小时以 上，然后于100oC加热15分钟或 高压灭菌15分钟，去除残余 DEPC。
• 2．RNA提取中RNase污染的控制 • 最主要的潜在污染源是操作人员的 手，手直接触摸之处毫无疑问会留 下RNase，另外，说话带出的唾液 也富含RNase，故在涉及RNA的一 切操作过程中，都应戴一次性手套 和口罩。
• 1．提取RNA所用器皿的 处理及溶液的准备
• 塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使 用灭菌的一次性用品。
• 玻璃用品：如烧杯、试管和其他 用品，常被RNase污染，使用前 必须于180oC干燥8小时以上， 或用0.1%DEPC水(焦碳酸二乙酯) 浸泡处理。
• DEPC是RNase的强抑制剂，作 用机制是通过与蛋白质中的组氨 酸结合，使蛋白质变性。37oC 浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗 数次，于100oC干烤15分钟，去 除器皿上残余DEPC。
• 12000rpm，离心5分钟 • 弃上清，用预冷70%乙醇洗两次，室温干燥5 分钟 • 加适量TE缓冲液或无菌去离子H2O溶解DNA， 混匀 • 紫外分光光度仪测OD值，4oC备用
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• 说明： • 回收上层水相时，一定不要接触两相的 界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心 管。 • 沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。 另：异丙醇、醋酸钠等。
• 加入等体积饱和酚,充分混匀
• 12000rpm,离心5分钟 将上层水相移至一干净离心管内， 加等体积酚/氯仿(1:1)混合液， 混匀
• 12 000rpm，离心5分钟
• 取水相，移至一干净离心管内，加等体 积氯仿，混匀后12000rpm，离心5分钟
• 取水相，移至一干净离心管内，加2倍体 积预冷的无水乙醇，沉淀DNA • 摇匀，可见白色絮状DNA，置-20oC， 30分钟或过夜
– 把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅 载体上，这种载体只对核酸有较强的亲 和力和吸附力，对其他生化成分如蛋白 质、多糖、脂类则基本不吸附，因而在 离心时被甩出柱子。
•
一些病原体，如乙肝病毒 （HBV）、丙肝病毒（HCV）、 人类免疫缺陷病毒（HIV）等的 PCR检测常采用血清或血浆标本。
• HBV：标本通常由医护人员采集， 应注意避免溶血，如为血浆标本 注意抗凝剂的选 择，一般用 EDTA-Na2或枸橼酸纳，不可使 用肝素。标本为全血时，及时分 离出血浆，提取病毒DNA进行 检测。
• 70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的 盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为 SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不
与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去 除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影 响。 • TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl • 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8
• RNA的提取
• RNA提取条件较DNA要求严格，主要 是因为临床标本及实验室环境中，存在 大量对RNA有强烈降解作用RNase。 RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。 这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也 不能使之完全失活。
• 蛋白质变性剂可使之暂时失活，但 变性剂去除后，又可恢复活性。除 细胞内RNase以外，环境中灰尘、 各种实验器皿和试剂、人体的汗液 及唾液中均存在RNase，因此在提 取RNA时，关键要避免RNase对标 本的污染及防止RNase对提取的 RNA的降解。
• SDS可与蛋白 质结成复合物， 使蛋白质变性沉淀，但SDS在以 后的核酸提取过 程中必须除去。
• 痰标本
• 痰属于分泌物，临床上常用作结核 杆菌DNA测定样本，由于痰标本中 含大量粘蛋白和杂质，故在核酸提 取时，一定要对标本进行前处理， 即用4%NaOH液化，去除粘蛋白， 然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经 典法提取DNA。
• HCV：检测RNA病毒。由于RNA极 易降解，标本的制备和保存方式往 往可以影响测定结果。若用血浆标 本，应使用EDTA抗凝。严禁使用 肝素，因其对PCR扩增有抑制作用, 且无法在核酸提取过程中去除。抗 凝后6小时内分离血浆。如用血清标 本，则应尽快（2小时内）分离血清 进行检测，或-20oC保存。
• RNase虽可耐受多种处理，（如 煮沸）而不失活，但却会被 4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙 醇（破坏RNase蛋白质中的二硫 键）等还原剂所灭活，因而可从 组织中分离出完整RNA分子。 因此上述试剂是制备RNA的常 规试剂。
• 200µl血清（浆） • 加入200µl 20%PEG6000 • 4oC，3小时，12000rpm，4oC离 心15分钟 • 弃上清，加500µl裂解液（含异硫 氰酸胍、-β巯基乙醇等），混匀
• 全血标本
• • 通常用来提取外周血单个核细胞核酸： 如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA 等。 抗凝剂：一般使用EDTA-Na2、枸橼 酸纳，不使用肝素。
• 前处理：
• 1）加适量的红细胞裂解液（破膜液）， 裂解全血中的红细胞。 • 2）再加适量的细胞核裂液（破核液）， 裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释 放出来。 • 3）然后再加SDS（十二烷基硫酸钠） 等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋白。
• （三）核酸提取的其他方法(简单介绍):
• 胍盐提取结合二氧化硅吸附法 • 二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异 硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异 硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或 病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结 合在二氧化硅上，利用此特性可提取血 液和尿液中DNA和RNA。
• 2.TRIzol试剂提取RNA方法：
核酸的提取
• 核酸包括DNA、RNA两种分子，在 细胞中都是以与蛋白质结合的状态 存在，核酸提取的主要步骤为： • 裂解细胞 • 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、 脂类等生物大分子，去除其他不需 要的核酸分子，如提取DNA分子时， 应去除RNA，反之亦然。
• 沉淀核酸
• 纯化核酸，去除盐类，有机剂等 杂质
• (一)DNA提取的经典方法 • DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯 仿提取法。因为使用两种不同的有机溶 剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次 序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种 方法提取的DNA纯度高、片段大、效果 好，缺点是较为繁琐。
• 经前处理的标本加入蛋白酶K,摇匀
• 56oC温育1小时,或37 oC消化6小时 以上/过夜
• 6．脓液 • 粘稠脓液：同痰标本处理，先用 4%NaOH液化，再离心取沉淀提取 DNA。 • 水样脓液：直接离心，沉淀用生 理盐水洗2-3次后用于DNA提取。
7．组织
• 组织有新鲜组织和石蜡切片。 • 新鲜组织的处理步骤： • 先用生理盐水洗二次，然后将其 捣碎或剪碎（用眼科剪），加蛋 白酶K消化后提取核酸