接种环灭菌

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③分析细菌致病性。
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（二）革兰染色法
3. 步骤 涂片－→干燥－→固定－→染色
★涂片：接种环灭菌、平板取材、细菌涂布 ★干燥：自然干燥或热空气干燥 ★固定：通过火焰外焰三次
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★染色：初染、媒染、脱色、复染 ★镜检
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染色方法
影响革兰染色的关键步骤是脱色
1分钟
结晶紫
卢戈碘液 1分钟95％酒精 30S～1min 稀释复红
16
16
三、实验方法与结果 1. 培养基的制备过程和常用培养基的种类 培养基的制备过程：一般培养基的制备过程须以下步骤
准确称量培养基各成分、混合溶解、测定及矫正pH值、 分装、包装、灭菌、质量检1查7 、保存。
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（2）常用培养基的种类：根据不同细菌的营养要求
物理性状及用途进行分类
按物理性状分类：固体培养基、半固体培养基、液体培养基 按用途分类：培养基按用途可分为基础培养基、营养培养基
初染 水洗
媒染 水洗
脱色
水洗
复染
水洗
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干燥
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（三）细菌的基本形态的观察
（1）球菌：葡萄球菌，革兰阳性（紫色），呈葡萄串状 排列。
（2）杆菌：大肠埃希菌，革兰阴性（红色），两端钝圆， 排列无一定规律。
（3）弧菌：霍乱弧菌，革兰阴性（红色），菌体弯曲呈
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弧形，排列无一定规律。
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（四）细菌特殊结构的观察
一、实验目的
掌握 光学显微镜油镜的使用方法及保护 掌握 革兰染色的原理及操作方法 熟悉 球菌、杆菌、螺形菌三种细菌的基本形态
4
熟悉 鞭毛、荚膜、芽胞等细菌特殊结构
4
二、实验准备
1. 器材：球菌、杆菌、螺形菌标本片，鞭毛、荚膜、
芽胞标本片，光学显微镜，载玻片，接种环，酒精灯
2. 试剂：葡萄球菌和大肠埃希菌混合菌液、结晶紫染
鞭毛：伤寒沙门菌，用鞭毛染色法，可见菌体呈深红 色，周身鞭毛呈红色。 荚膜：肺炎球菌，用革兰染色，可见菌体染成紫色（ 革兰阳性），常成双排列，菌体周围有一未着色的空圈， 即荚膜所在处。 芽胞：破伤风芽胞梭菌，用革兰染色，可见菌体染成
14ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
紫色（革兰阳性），菌体顶端有1个圆形未着色的芽胞， 使整个菌体呈鼓槌状。
和小鱼际之间（勿乱放），将挑有细菌的接种环（或针）伸
入试管内，先在培养基斜面上，由底部到顶部拖一条接种线
，再自下而上的连续划曲线；试管口灭菌后加塞，接种环灭
菌，放回原处。
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③注明标记，置37℃温箱培养18～24小时观察结果。
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（3）液体培养基接种法
①左手持试管，试管与桌面成45°～60°夹角，右手持接 种环，火焰灭菌后，在琼脂平板上挑取单个菌落。
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、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基
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2. 细菌接种法 （1）平板培养基接种法——分区划线
灭菌接种环，取菌 第一区划线 灭菌接种环
第三区划线 灭菌接种环
灭菌接种环
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第四区划线
第二区划线
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三、实验方法与结果
注意事项： 划线接种时，力量要适中，接种环与培养基面的夹角45°～
60°夹角为宜，切勿划破平板表面； 划线时线与线之间保持一定距离，密而不重叠，使后一区细
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2. 消毒灭菌试验 皮肤消毒试验 紫外线杀菌试验 高压蒸气灭菌法
29
29
实验四 纸片扩散法抗菌药物敏感实验
一、实验目的
掌握 纸片扩散法抗菌药物敏感试验的原理、操作 方法和结果判断。
掌握 药物敏感试验的临床意义。
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二、实验准备
物品：普通琼脂平板、药敏纸片(庆大霉素、丁胺卡那霉 素、青霉素)、大肠埃希菌等
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实验二 细菌的人工培养
一、实验目的
1. 掌握 细菌的接种方法，熟练掌握无菌操作法。 2. 熟悉 培养基的制备过程及常用培养基的种类。 3. 熟悉 细菌在培养基中的15 生长现象
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二、实验准备
物品：葡萄球菌菌液、大肠埃希菌液、伤寒沙门菌、 培养基
实验器材：显微镜、载玻片、接种环、接种针、酒精 灯、培养皿
1. 微生物的分布检查试验
（1）空气中微生物的检查：取普通琼脂平板1个，将盖打开， 暴露于空气中10分钟，然后盖上，做好标记，置37℃温箱培 养18～24小时后观察结果。 （2）咽喉部微生物的检查 咳碟法：取血平板1个，将盖打开28，置于距口腔10 cm处，用力 咳嗽数次，然后盖好，置37℃温箱培养18～24小时后观察结果
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器材：接种环、酒精灯、镊子、恒温培养箱、高压蒸汽灭 菌锅、普通琼脂平板、药敏纸片(庆大霉素、丁胺卡那霉
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素、青霉素)、碘酊等
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三、实验方法与结果
菌液制备 细菌涂布 张贴药敏纸片 培养 结果判定 若该细菌对某种抗生素敏感，则在该药敏纸片周围有一
圈无细菌生长的区域，称抑菌环或抑菌圈。测量抑菌环直径 的大小，查表即可得出细菌对该药物的敏感度。一般以敏感 、中度敏感、耐药3个等级报告32 结果，对毒副作用较大的药 物只能以敏感和耐药2个等级报告结果。
（1）固体培养基 通过分离培养，细菌可在固体培养基上形成菌落。 如果固体培养基上的菌落因密集而融合成一片，则称为菌苔。
（2）液体培养基 大多数细菌在液体培养基中的生长呈现均匀浑浊状 态；少数链状的细菌由于重力关系下沉而为沉淀生长；专性需氧菌呈 表面生长，形成菌膜。
（3）半固体培养基 有鞭毛的细菌25沿穿刺线向周围扩散生长，穿刺线 模糊，整个培养基变成浑浊。无鞭毛的细菌只沿穿刺线生长，穿刺线 清晰，周围培养基透明。
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（3）液体培养基接种法
②左手持液体培养基试管，右手拔取试管塞，夹于小指和 小鱼际之间，将挑有细菌的接种环伸入试管内，在接近液面 上方的管壁上轻轻研磨，并蘸取少许液体调和，使细菌混合 于液体培养基中。
③接种环灭菌，放回原处。2注4 明标记，置37℃温箱培养 18～24小时后观察结果。
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3. 细菌在培养基中的生长现象
7
3. 油镜的保养方法
（1）标本观察完毕，向上转动粗调节器将镜筒提起，取 下标本，用擦镜纸将镜头上的油擦净。若油已干，可用擦 镜纸沾少许二甲苯擦去油迹，随即用擦镜纸擦去二甲苯。 （2）将物镜转成“八” 字形，以免损坏油镜。降低集光 器，竖起反光镜，将显微镜放8入镜箱。
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（二）革兰染色法
1. 原理：由于不同细菌细胞壁结构、等电点及菌内的核糖
核酸镁盐含量不同等原因，经此法染色，可将所有的细菌分 为2大类，革兰阳性菌（G+菌，细菌染成紫色）和革兰阴性 菌（G-菌，细菌染成红色）。9
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（二）革兰染色法
2. 意义：
①鉴别细菌，缩小鉴定范围；
②选择药物：革兰阳性菌和革兰阴性菌对不同药物的敏
感性不同，因此可根据革兰染色的结果来选择合适的抗
生素来治疗疾病；
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实验三 微生物的分布检查及消毒灭菌
一、实验目的
1. 掌握 微生物的分布，进一步建立无菌观念。 2. 掌握 常用的物理和化学消毒灭菌方法。
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二、实验准备
物品：棉拭子、血平板、普通琼脂平板、碘酊 器材：接种环、酒精灯、镊子、恒温培养箱、高压蒸
汽灭菌锅、紫外灯
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三、实验方法与结果
菌量少于前一区，逐渐减少直至划线上的细菌呈单个细菌，
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生长繁殖后形成单个菌落； 充分利用平板表面；严格无菌操作。
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（2）斜面培养基接种法
①左手持试管，试管与桌面成45°～60°夹角，右手以笔式、持 接种环或接种针，火焰灭菌后，在琼脂平板上挑取单个菌落。
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（2）斜面培养基接种法
②左手持琼脂斜面培养基试管，右手拔取试管塞，夹于小指
第三十二章 微生物实验
王楠 江苏医药职业学院
目录 一、细菌形态学检查 二、细菌的人工培养 三、微生物的分布及消毒灭菌 四、纸片扩散法抗菌药物敏感实验
重点难点：
重点： 掌握微生物学实验基本的实验操作技能、 纸片扩散法抗菌药物敏感试验
难点：掌握微生物学实验基本的实验操作技能
实验一 细菌形态检查
液、香柏油、蒸馏水
5
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三、实验方法与结果
油镜的使用和保护 （一）油镜的使用及保养
1. 显微镜基本知识 显微镜的构造
（1）光学部分 （2）机械部分
6
放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
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2. 油镜的使用方法
1）将显微镜直立于桌上，不要扳动倾斜关节，使载物台保持水平。 2）对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强。要抬高集光器， 放大光圈。 3）滴加香柏油一小滴于染色标本片上，将标本置于载物台上，移置待 检部分于接物镜下。 4）换用油镜，眼睛从侧面看着物镜，转动粗调节器，使镜筒下降至油 镜头浸入镜油并几乎接触标本片。 7 5）左眼看接目镜，一面观察，一面缓慢转动粗调节器，使镜筒上升， 直到观察到模糊的物像时，再适当转动细调节器，使物像完全清晰， 即可正式观察。