实验三 电子显微镜技术的演示

实验三电子显微镜技术的演示
背景知识：
普通光学显微镜通过提高和改善透镜的性能，使放大率达到1000~1500倍左右，但一直未超过2000倍。

这是由于普通光学显微镜的放大能力受光的波长的限制。

为了从更高的层次上研究物质的结构，必须另辟蹊径，创造出功能更强的显微镜。

20世纪20年代法国科学家德布罗意发现电子流也具有波动性，其波长与能量有确定关系，能量越大波长越短，比如电子学1000伏特的电场加速后其波长是0.388埃，用10万伏电场加速后波长只有0.0387埃，于是科学家们就想到是否可以用电子束来代替光波，这是电子显微镜即将诞生的一个先兆。

用电子束来制造显微镜，关键是找到能使电子束聚焦的透镜，光学透镜是无法会聚电子束的。

1926年，德国科学家蒲许提出了关于电子在磁场中运动的理论。

他指出：“具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。

”这样，蒲许就从理论上解决了电子显微镜的透镜问题，因为电子束来说，磁场显示出透镜的作用，所以称为“磁透镜”。

1931年，德国柏林工科大学的Knoll和Ruska制作成功第一台电子显微镜──它是一台经过改进的阴极射线示波器，成功地得到了铜网的放大像──第一次由电子束形成的图像，加速电压为7万，最初放大率仅为17倍。

尽管分辨率还不如光学显微镜高，但它却证实了使用电子束和电子透镜可形成与光学像相同的电子像。

经过不断地改进，1933年Ruska和Bodo Von Borries又制成了第二台两级短焦距的电子显微镜，获得了金属箔和纤维的放大1万倍的电子图像。

虽然放大率得到提高，但分辨率当时还刚刚达到光学显微镜的水平。

1937年应西门子公司的邀请，Ruska建立了超显微镜学实验室。

1939年西门子公司制造出分辨本领达到30埃的世界上最早的实用电子显微镜，并投入批量生产。

随后，透射电镜的商业产品由美国无线电公司于1941年开始制作生产。

电子显微镜的出现使人类的洞察能力提高了好几百倍，不仅看到了病毒，而且看见了一些大分子，即使经过特殊制备的某些类型材料样品里的原子，也能够被看到。

但是，受电子显微镜本身的设计原理和现代加工技术手段的限制，目前它的分辨本领已经接近极限。

要进一步研究比原子尺度更小的微观世界必须要有概念和原理上的根本突破。

1978年，一种新的物理探测系统──扫描隧道显微镜已被德国学者Binnig和瑞士学者Rohrer系统地论证了，并于1982年制造成功。

这种新型的显微镜，放大倍数可达3亿倍，最小可分辨的两点距离为原子直径的1/10，也就是说它的分辨率高达0.1埃。

扫描隧道显微镜采用了全新的工作原理，它利用一种电子隧道现象，将样品本身作为一具电极，另一个电极是一根非常尖锐的探针，把探针移近样品，并在两者之间加上电压，当探针和样品表面相距只有数十埃时，由于隧道效应在探针与样品表面之间就会产生隧穿电流，并保持不变，若表面有微小起伏，那怕只有原子大小的起伏，也将使穿电流发生成千上万倍的变化，这种携带原子结构的信息，输入电子计算机，经过处理即可在荧光屏上显示出一幅物体的三维图像。

鉴于Ruska发明电子显微镜，Binnig、Rohrer设计制造扫描隧道显微镜的业绩，瑞典皇家科学院决定，将1986年诺贝尔物理奖授予他们三人。

1953年瑞典人制造成功较完善的超薄切片机和随之出现的各种电子染色方法，使超薄切片技术得到迅速发展，从而推动了电子显微镜技术在生物学领域中的广泛应用。

目前生物
电子显微镜技术已有细胞水平发展到分子水平和原子水平。

英国医学委员会分子生物学实验室的A. Klug博士将高分辨电子显微镜技术应用于生物大分子的结构测定上，由于他在核酸-蛋白质复合体的晶体结构研究方面做出的卓越贡献，荣获了1982年的诺贝尔化学奖。

随着科学技术和生产实践的发展，电子显微镜得到不断改进、更新和完善，分辨率得到提高。

现代高性能透射电子显微镜的点分辨率（point resolution）已优于0.3nm，晶格分辨率（lattice resolution）已达0.1~0.2nm。

放大倍数从第一台电镜的十几倍提高到几十万甚至几百万倍。

此外，电子显微镜的种类不断增加，功能不断扩展。

除观察样品内部超微结构（ultramicrostructure）的透射电子显微镜和揭示样品表面形貌的扫描电子显微镜外，能同时观察样品表面和内部超微结构，乃至单个原子像的高分辨场发射枪扫描透射电子显微镜（scanning transmission electron microscope，STEM）已经问世。

另外，用于对样品中某些化学元素进行综合分析的分析电子显微镜（analytical electron microscope）、可观察活细胞的高压透射电子显微镜（high voltage transmission electron microscope，HVTEM）、能观察含水样品的低温透射电子显微镜（cryotransmission electron microscope，CTEM）等各种专用电子显微镜也已开始使用。

近年来，计算机技术开始用于电子显微镜。

电镜观察时大部分操作可用计算机控制，如样品的移动和放大倍数的调控等，使电镜操作简便易行。

而计算机在图像显示、处理和存储等方面的优势，则更为电子显微镜的应用提供了加大方便。

可以预料，基于Internet网络技术的电子显微镜在远程教学和科研方面将发挥越来越重要的作用。

一、实验目的
了解电子显微镜的工作原理和结构；观摩超薄切片技术演示；了解电镜图像反差来源的基础；判断、识别电镜下细胞中的各种亚显微结构。

二、实验材料
电子显微镜、超薄切片机、制片机、动物或植物细胞的超薄切片、各种细胞亚显微结构照片。

三、实验原理和演示
电镜理论学习与上机观察，超薄切片及制刀演示，参观电镜照片等三部分内容分组交叉进行。

为节约时间，收取实效建议每组10人，以两组或三组，争取2~3h完成全部内容。

1．电子显微镜工作原理和结构简介
显微镜的两大要素：光源和透镜，两者缺一不可。

光学显微镜采用可见光和玻璃透镜。

而电子显微镜是利用高压加速电子束和电磁透镜，这一基本原理是相同的。

由于照明源的不同，光镜与电镜的成像机理有本质区别。

前者的成像过程是样品对可见光的反射与吸收，整个过程总是在大气中。

电子显微镜则是在高真空系统中，快速电子来照射样品时，入射电子要与样品物质中的原子结构发生碰撞作用，原于核与核外层电子都会对入射电子有碰撞引起的散射，导致部分电子的运动方向和能量变化。

样品中不同结构不同区域致密度不同，散射程度也不尽相同，所以穿过样品的出射束是不均匀的电子束，束内电子密度各处互有差异，当其投射到荧光屏上就会形成描绘结构信息的可见光强度反差图像。

因此电子显微镜的成像机理是散射。

电子显微镜的透镜都是电磁透镜，由短线圈、具内环间隙的软铁壳和极靴三部分组成。

现代透射电镜基本结构（图1-13）包括：电子光学系统；真空系统；电气系统；水冷却循环系统和压缩空气系统等。

主体是电子光学系统，简称为镜筒。

考虑到机械稳定性、真空度易保性，电镜镜筒都制成直立式的，自下而上由—个个电磁透镜垒起来。

镜筒的完整构造，包括以下四大部分：
（1）照明系统
电子枪一—发射电子并加速电子束，是以阴极、栅极和阳极三极管式组成。

第一聚光镜—一控制电子束束斑直径大小。

第二聚光镜—一—控制电子束强度，改变
照明的强弱程度。

此系统的调节用于获得良好的照明束。

（2）样品室
样品移动机械装置一移动样品选择视场。

测角台—一侧插式进样气锁装置，并用于
控制样品与电子束的倾斜角。

（3）成像系统
物镜一一形成第一幅高分辨图像的透镜，物镜电流的变化主要用来聚焦图像。

中间镜一一控制图像的放大倍率，调节中间
镜电流可连续改变放大倍数。

投影镜——它将最终放大图像投射到观察室
荧光屏。

（4）观察记录系统
观察室——由铅玻璃窗围成的观察室内，装有将电子像转换成可见光反差的荧光屏。

照相装置——随时可把需要的图像拍照记录下来。

电镜正常运行时，整个电子光学系统保证在高真空状态，观察者依靠电气调节操作观察。

电镜是在光学显微镜的基础上发展起来的，因此在功能和工作原理上，二者有相同之处，但又各具特色。

电子显微镜的许多优点是光学显微镜所不能比拟的，而光镜的体积小，可为彩色图像，使用方便，又为电镜所不及。

现就光学显微镜和透射电镜的主要区别，列于表1-4说明。

表1-4 光学显微镜和透射电镜的主要区别
比较项目光学显微镜透射电镜
光源可见光电子束
介质大气真空
透镜玻璃透镜电磁透镜分辨本领200nm 0.2nm
放大倍数1000倍80万~100万倍
聚焦方式机械操作电磁控制
图像颜色彩色黑白
成像方式直接成像荧光屏成像
（1）透射电镜的成像原理
透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。

透射电镜的分辨率为0.1~0.2nm，放大倍数为几万
~几十万倍。

由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50~100nm）。

其制备过程与石蜡切片相似，但图1-13光学显微镜和电子显微镜（透射电镜）的结构比较（引自Wolfe，1993）
要求极严格。

要在机体死亡后的数分钟后取材，组织块要小（1mm3以内），常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片机切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。

电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。

称电子密度高（electron dense ）。

反之，则称为电子密度低（electron lucent ）。

（2）扫描电镜的成像原理 扫描电镜电子枪发射出的高能电子，被电磁
透镜聚集成极细的电子束，在扫描发生器的激励下，电子束在样品表面作光栅样扫描，激发样品产生各种物理信号，其强度对样品表面特征而不同。

于是样品表面的不同的特征按顺序、成比例地被转换成视频信号，并经视频放大处理，在同步调制阴极射线管的电子束强度，最后在显像管的荧光屏上，得到一幅与电子束在样品表面扫描区相对应的样品表面构像，可摄制成照片。

扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥后，再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数。

扫描电镜能观察较大的组织表面结构，样品图像富有立体感。

2．电镜样品制备技术和方法
在透射电镜生物样品的制备技术中，超薄切片技术是最重要最基本的一种。

目前应用的冷冻切片技术、电镜细胞化学技术、电镜放射自显影技术等都是以超薄切片技术为基础。

“超薄切片”是指施用超薄切片机切割样品，保证厚度在0.1nm 以下的切片，最好为60nm 左右。

这样的超薄片才能保证电子束透过样品传递结构信息。

良好的超薄切片，应该是薄而均匀，没有皱折、刀痕、震颤等缺陷，尤其在制作过程的各个环节，要力求细胞微细结构保存良好，无人为假像，染色要适当，避免沉淀与污染且具有良好的反衬度。

超薄切片的制作步骤包括：
（1）取材：从生活状态的生物体中取得所需材料。

为尽可能保持原生活状态的组织结构，必须操作准确、迅速，取样体积小防损伤。

（2）固定：迅速终结细胞活性的过程谓之固定，因此取材后要立即进行固定处理。

常用方法是化学固定法，固定液有锇酸、醛类、高锰酸钾等。

（3）脱水：这一步是把组织细胞中的游离水去掉，因为水分的存在会使组织结构在电镜高真空状态下急骤收缩而遭破坏。

另外目前多用非水溶性包埋剂，细胞游离水会影响包埋剂的浸透，所以脱水是重要步骤。

常规“梯度脱水法”按30％-50％-70％-80％-95％-100％逐级加大脱水剂的浓度，逐步把水分置换出来。

脱水剂有乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇等。

（4）包埋：用包埋剂取代脱水后的组织块中的脱水剂，并制成适于超薄切片机易切割的固体块，好的包埋块才能切出高质量的连续切片。

（5）切片：利用样品臂金属杆热胀冷缩的微小长度变化进行切片。

超薄切片的整个过图1-14 扫描电子显微镜的光学系统（引自
Wolfe ，1993）
程为修块、制刀、切片、捞片等步骤。

（6）染色：将捞到支持铜网上的切片进行电子染色。

单染法：只用一种染液染色，大多是用铅染色，效果较好。

有些情况为了避免铅的干扰，则单独使用铀染色。

双染法：先用醋酸铀染色，而后再用柠檬酸铅染色，这是目前普遍采用的方法，染色效果较好。

染完色的超薄切片，用蒸馏水反复冲洗，除去多余染色液，待干燥后，即可镜检。

3．样品的观察、识别和分析
（1）学习侧插式样品支架的使用方法，按仪器操作说明书实际操作演示，并将准备好的超薄切片铜网放人支架上。

（2）给电镜进样、启动高压获得照明。

假如电子光学系统已经对中调好状态，那末就用样品移动杆选择观察视场，调节中间镜电流到适当的放大倍数，配合调节第二聚光镜选择合适的亮度，开始观察分析荧光屏上的结构图像。

（3）预先选择准备好的动物或植物样品切片供观察分析。

例—、鼠小肠上皮细胞切片
首先在5000倍左右对切片进行普查。

可看到上皮细胞形状规则，排列整齐，细胞间接触紧密。

随着放大倍增高，可看到上皮细胞的连接由微绒毛、微原纤维向内伸延，20 000倍的视场内可见上皮细胞的紧密连接，中间连接和桥粒构成的细胞间的复合连接体。

例二、鼠肝细胞超薄切片
观察内容：细胞核（双层核膜，核孔核仁）、粗面内质网（囊状膜上附着核糖体）、光面内质网、高尔基复合体、线粒体、溶酶体等。

例三、玉米叶片的超薄切片
在5000倍左右下，观察叶肉细胞，可见完整细胞并易找到叶绿体部位。

将此部位移到视场中心，提高放大倍数到30000倍就可看到维管束鞘中的叶绿体，不重叠排列的类囊体。

（4）电镜照片参观
根据本电镜实验室的特色，挑选一批动植物、微生物和病毒等方而的典型电镜照片，让同学学习各种细胞器的结构特征。

四、作业
1．比较电子显微镜和光学显微镜的异同，按要求填写下表。

电子显微镜光学显微镜光源
波长
分辨率
介质
透镜
聚焦方式
放大率
2．区分细胞的显微结构与亚显微结构，辨认各种细胞器的结构特征。