生物制药工艺学（葛驰宇）课后习题参考答案

课后习题参考答案
模块一生物制药基础理论
任务一生物制药概述
一、名词解释
1．生物药物：是指利用生物体、生物组织、体液或其代谢产物（初级代谢产物和次级代谢产物），综合应用化学、生物化学、生物学、医学、药学、工程学等学科的原理与方法加工制成的一类用于疾病的预防、治疗和诊断的物质。

2．生物制药：是指以生物体为原料或借助生物过程，在人为设定的条件下生产各种生物药物的技术。

二、填空题
1．化学药物、生物药物、中草药；2．二、三
三、问答题
1．生物制药的特点是什么？
答：（1）药理学特性：生物药物在人体中具有相对较高的相容性和针对性。

.治疗的针对性强，疗效高；营养价值高，毒副作用小；免疫性副作用常有发生；（2）原料的生物学特性：天然来源的原料中药理学活性成分含量低，杂质多；来源广泛，多种多样；原料容易腐蚀变质；（3）生产制备过程的特殊性；（4）检测的特殊性；（5）剂型要求的特殊性。

2．按照生物药物的化学本质和化学特性分类，可将生物药物分为哪些类别？
答：按照生物药物的化学本质和化学特性分类，可将生物药物分为氨基酸类药物、多肽和蛋白质类药物、酶类药物、核酸类药物、多糖类药物、脂类药物、维生素与辅酶、其他类。

3. 简述生物制药工业的发展历史及现状。

答：学生可自己从学术网站、报刊杂志等渠道获取相应信息。

任务二生物制药工艺基本技术
一、名词解释
1．MTT：即四甲基偶氮唑盐比色法，是通过快速简便的颜色反应来检测细胞存活数量。

其原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物，当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的针状甲瓒（Formazan）结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其吸光度值，该值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。

2．发酵：指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。

3．自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变（亦称自然突变）而进行菌种筛选的过程。

4．固定化酶：通常酶是游离的，而经过固定化以后，酶被束缚在一定区域内，因而这样的酶被称为固定化酶。

5．离子吸附法：是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体通过静电作用相结合的一种固定化方法。

6. 电泳技术，是指在电场作用下，带电颗粒在由于所带的电荷不同以及分子大小差异而有不同的迁移行为从而彼此分离开来的一种实验技术。

7. 萃取技术：是根据原料中目标产物在原料液和萃取剂中分配行为的差别，进行的分离提取操作；萃取剂可以是液体或超临界流体。

8. 色谱技术：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。

9. 加压膜技术：在一定压力下，使小分子溶质和溶剂穿过具有一定孔径的特制薄膜，而使大分子溶质不能透过留在膜的一侧从而使大分子溶质得到部分的纯化的过程。

10.沉淀技术：是通过改变条件或加入某种试剂，使发酵溶液中的溶质由液相转变为固相的过程。

二、填空题
1．反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工化学合成法。

2．在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，；分子量尽可能小；不易被机械剪切而破坏；载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因）；载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点。

3. 595。

4．酶的稳定性提高；酶反应条件容易控制；可实现批量或连续操作，适于产业化、连续化、自动化生产。

6．斜面低温保藏法；液体石蜡保藏法；半固体穿刺保藏法；沙土管保藏法；加入保护剂冻存保藏法；冷冻真空干燥保藏法。

7. 超声波处理、反复冻融、干燥、渗透压冲击。

8. 盐析、结晶、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、亲和沉淀、表面活性剂沉淀。

9. 分离效率高、应用范围广、选择性强、方便快捷。

10. 吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱。

11. 超滤、微滤、反渗透、纳米过滤、电渗析、透析
12. 核酸、蛋白质。

三、问答题
1．MTT法的应用
答：（1）检测细胞活性：常作为细胞毒性试验的一种方法。

（2）体外药物敏感实验：该方法简便、经济、快速，重复性好，所需的细胞数较少，没有放射性，目前广泛地用于临床前的抗癌药物的筛选研究。

（3）一些细胞因子活性的研究。

2．发酵过程中有哪些条件需要控制？
答：发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。

其主要特点如下：
（1）发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。

（2）发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。

微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。

基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。

（3）发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。

（4）由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。

（5）一般情况下，发酵过程中需要特别控制杂菌的产生。

通常控制杂菌的方法是对设备进行严格消毒处理，对空气加热灭菌操作以及尽可能地采用自动化的方式进行发酵。

通常，如果发酵过程中污染了杂菌或者噬菌体，会影响发酵过程的进行，导致发酵产品的产量减少，严重的，甚至会导致整个发酵过程失败，发酵产品被要求全部倒掉。

（6）微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优
良菌株并使生产设备得到充分利用，甚至可以获得按常规方法难以生产的产品。

3．菌种选育的意义
答：微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键，只有具备良好的菌种基础，才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品，因此在发酵前期必须进行菌种选育工作。

菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展。

通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍。

菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和生产菌的遗传学研究等方面也发挥重大作用。

菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。

4．固定化酶的发展趋势
答：（1）建立多酶固定化系统固定化酶有许多粗酶液没有的特点，但制备固定化酶首先要经过大量复杂的分离、纯化工作，而且一种固定化酶只能用于特定的单步反应。

应这种要求，工业生产中越来越多地应用了固定化细胞技术。

这样就省去了酶分离纯化的时间和费用;并可同时进行多酶反应;而且可以保持酶在细胞中的原始形态，增加了酶的稳定性。

（2）探索新型载体进一步对天然高分子载体的不断挖掘和探究，对其进行改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶，解决固定化酶的稳定性和高效性。

（3）开发新型、高效固定化酶反应器一方面反应器还应该包括酶辅因子再生系统，保证需要辅酶的酶正常发挥作用；另一方面直接将使用遗传工程技术培养的优良菌株、固定化技术和连续反应器巧妙结合，简化生产过程。

5．试述凝胶色谱的原理。

答：将混合原料加在柱上并用流动相洗脱，则无法进入孔隙内部的大分子直接被洗脱下来，小分子因为可以进入孔隙内部而受到很大的阻滞，最晚被洗脱下来，而中等大小的分子，虽然可以进入孔隙内部但并不深入，受到的阻滞作用不强，因而在两者之间被洗脱下来。

6．简述盐析的原理及产生的现象。

答：当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：
（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大
（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：
①无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；
②中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。

7．简述树脂的再生活化方法。

答：所谓树脂的再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程，树脂的再生反应是交换吸附的逆反应。

再生方法可根据污染情况和条件而定，一般阳树脂在软化中易受Fe3+污染，清除铁化合物的方法，通常是用加抑制剂的高浓度盐酸（10%~15%）浸泡树脂5~12 h，甚至更长。

也可用柠檬酸、氨基三乙酸、EDTA等络合物进行处理。

模块二典型生物药品的生产与质量控制
任务一氨基酸类药物的生产与质量控制
一、名词解释
1．氨基酸类药物：是以氨基酸和（或）氨基酸衍生物为原料，通过单一氨基酸或多种氨基酸混合制剂后具
有疾病诊断、治疗和预防等功能的物质。

2．复方氨基酸输液：将多种结晶L-氨基酸依特定比例混合配制而成的复方静脉内输注液称为复方氨基酸输液；
二、填空题
1．蛋白质水解提取法、微生物发酵法、酶合成法和化学合成法；
2．必需氨基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸；
3．酸解法、碱解法和酶解法；
4．化学合成法、微生物发酵法和固定化细胞法；
5. 离子交换、真空浓缩、中和析晶、脱色重结晶和干燥等阶段。

三、问答题
1．氨基酸药物的类别有哪些？
答：（1）复方氨基酸输液。

将多种结晶L-氨基酸依特定比例混合配制而成的复方静脉内输注液称为复方氨基酸输液；（2）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物。

主要有谷氨酸及其盐酸盐、谷氨酰胺、乙酰谷酰胺铝、甘氨酸及其铝盐等；（3）治疗肝病的氨基酸及其衍生物。

主要有精氨酸盐酸盐、磷葡精氨酸、鸟天氨酸、谷氨酸钠、甲硫氨酸等；（4）治疗脑及神经系统的氨基酸及其衍生物。

常见的有谷氨酸钙盐及镁盐、氢溴酸谷氨酸、色氨酸、5-羟色氨酸等；（5）治疗肿瘤的氨基酸及其衍生物。

常见有偶氮丝氨酸、磷乙天冬氨酸及重氮氧代正亮氨酸等；（6）其他类氨基酸药物。

2．氨基酸类药物的制备方法有哪些？
答：目前，除少数几种氨基酸用蛋白水解提取法、酶合成法和化学合成法外，大多数氨基酸以发酵法进行生产。

（1）化学合成法。

化学合成法是指利用化学合成技术生产氨基酸的生产方法，是制备氨基酸的重要方法。

常以α-卤代羧酸、醛类、α-酮酸及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩合、取代及氧化还原等化学反应合成；（2）酶合成法。

也称酶转化法，是指在特定的酶催化作用下使某些化合物转化成氨基酸的生产技术，以氨基酸前体为原料，将含特定酶的微生物、动植物细胞进行固定化处理，通过酶促反应制备特定氨基酸；（3）蛋白质水解提取法。

以富含蛋白质的物质为原料，通过酸、碱或蛋白酶进行水解得到氨基酸混合物，产物经分离、精制和结晶后得到各种氨基酸，有酸解法、碱解法和酶解法3种方法；（4）微生物发酵法。

微生物发酵法由微生物接种、发酵培养、产物分离与纯化等操作步骤组成，主要以细菌和酵母菌发酵生产为主。

目前，如谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸等大多数氨基酸可通过发酵法生产。

3．请阐述天L-天冬氨酸合成的方法有哪些。

答：主要以化学合成法、微生物发酵法和固定化细胞法生产为主。

（1）化学合成法。

是以马来酸或延胡索酸及其酯为原料，在加压条件下用氨处理，然后进行水解得到外消旋的天冬氨酸，由于没有较好的拆分方法，故应用较少；（2）微生物发酵法。

是在微生物酶的催化作用下，以延胡索酸与氨为原料，通过加成反应生成天冬氨酸，产物只有左旋体，收率高，是L-天冬氨酸工业化生产的主要方法；（3）细胞固定法。

用含天冬氨酸酶活性菌体直接将延胡索酸（富马酸）和氨转化成L-天冬氨酸，此法也成为工业化大规模生产L-天冬氨酸的主要方法。

任务二多肽和蛋白质类药物的生产与质量控制
一、名词解释
1. 多肽和蛋白质类药物：指用于预防、治疗和诊断的多肽和蛋白质类物质生物药物。

多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物,它也是蛋白质水解的中间产物。

N条多肽链按一定的空间结构缠绕纠结就构成了蛋白质。

大分子蛋白质水解会生成多肽。

2. Western杂交：是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。

二、填空题
1．生化提取法，基因工程菌（或细胞）生产法；
2．溶剂萃取法，发酵法，酶法，化学合成法，酵母发酵制备法；
3．理化鉴别法，生物鉴别法，SDS-PAGE，HPLC，SDS-PAGE法，等点聚集电泳，毛细管电泳法；4．安全检查，外源性污染物检查，过敏性物质检查
三、问答题
1. 蛋白质与多肽药物的优缺点是什么？
答：相比小分子药物，多肽与蛋白质药物生物活性更高、特异性更强、生理毒性更低以及生理功能更确切，但也存稳定性差、易被消化酶降解、生物半衰期短、扩散性差、分配系数小且难于通过生物屏障及脂质体膜等先天性不足，通过化学与生物修饰，可改善原有药物的生物利用度、改善生物组织的适应性、增强受体-配基作用力以及增加药物-受体的选择性和适配性，使多肽及蛋白质类药物的临床应用效果有显著提高。

2. 多肽和蛋白质药物的分类有哪些？
答：多肽类药物是由2~50个氨基酸通过肽键（酰胺键）连接而成的链状化合物，分子量较小，无特定空间构象。

在生物体内活性高，浓度低，对机体有重要调节作用，主要包括激素类和生长调节因子类等。

蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用等特点，分为单纯蛋白质药物和结合蛋白质药物。

3. 请简述小牛胸腺素的提取工艺路线。

答：小牛胸腺素提取工艺包括提取、加热去杂蛋白、沉淀、分段盐析、超滤除盐和脱盐和干燥等过程。

（1）提取。

将新鲜或冷冻胸腺剔去脂肪组织，搅碎后加入约3倍量的生理盐水并于组织捣碎机高速捣碎，制成组织匀浆，14000 r/min离心后得提取液（组分1，F1）或1500 r/min离心30 min，上清液再用纱布过滤得组分F1。

（2）加热去杂蛋白。

组分F1于80℃加热15 min，以沉淀对热不稳定的杂蛋白部分。

冷却至室温后，1500 r/min 离心30 min，去掉沉淀，得上清液（组分2，F2）；（3）沉淀。

组分F2冷却至4 ℃，加入5倍体积的-10 ℃预冷的丙酮溶液沉淀，过滤收集沉淀，干燥后得到丙酮粉（组分3，F3）。

（4）分段盐析。

将丙酮粉（组分F3）溶于pH7.0磷酸盐缓冲液中，加硫酸铵到饱和度为25%，1500 r/min 离心除去沉淀，收集上清液（组分4，F4）。

组分F4调pH4.0，加硫酸铵至饱和度50%，得盐析物。

（5）超滤除盐。

将盐析物溶于pH8.0的10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，超滤，取分子量在15000以下的超滤液；（6）脱盐和干燥。

超滤液经SephadexG-25脱盐处理后，冷冻干燥即得胸腺激素（组分5，F5）。

4．请简要阐述胸腺肽的生产工艺路线。

答：胸腺肽的生产工艺包括原料预处理、组织匀浆和提取、部分热变性、离心和过滤和超滤、提纯、分装和冻干等操作过程。

（1）原料预处理。

取-20℃冷藏的小牛（或小猪、小羊）胸腺，用无菌剪刀剔去附属脂肪组织和筋膜等组织，用冷无菌蒸馏水洗涤干净并置于无菌绞肉机绞碎；（2）组织匀浆和提取。

将绞碎的胸腺组织与冷重蒸馏水按1:1比例混合均匀，于10000 r/min高速组织捣碎机中捣碎1 min，制成腺组织匀浆；10 ℃以下浸渍提取，并放置在-20℃冰冻储藏48 h；（3）部分热变性、离心和过滤。

将冷冻胸腺组织匀浆融化处理后，置水浴上搅拌加温至80℃并保温5 min，迅速降温，并置于-20 ℃以下冷藏2~3 天，然后取出融化，并以5000 r/min离心40 min，2 ℃条件下收集上清液，除去沉淀，收集得到的上清液用滤纸或微孔滤膜（0.22 μm）减压抽滤，收集澄清滤液；（4）超滤、提纯、分装和冻干。

将澄清滤液用分子量截留值为10000以下的超滤膜进行超滤，收集分子量<10000的活性多肽，得胸腺肽精制液，并置-20℃冷藏；检验合格后，加入3%
甘露醇作赋形剂，用微孔滤膜除菌过滤、分装、冷冻干燥，即得注射用胸腺肽。

任务三核酸类药物的生产与质量控制
一、名词解释
1．核酸类药物：是具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷以及碱基的统称。

2．定磷法：DNA是磷酸与戊糖通过磷酸二酯键形成的生物大分子，由于每个DNA序列中磷酸的含量固定，因此磷酸的量正比于DNA的量，即通过测定磷酸的量来测定DNA的量，称为定磷法。

二、填空题
1．天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或衍生物；具有天然结构的核酸类物质。

2．酶解或化学降解法、发酵法、半合成法。

三、问答题
1．RNA的纯化方法有哪些？简述其原理。

答：常用的方法有密度梯度离心法、柱色谱法与凝胶电泳法。

（1）密度梯度离心法常采用蔗糖溶液作为分离RNA的介质，建立从管底向上逐渐降低的浓度梯度，管底浓度在30%，管上的浓度在5%，然后将RNA混合样品轻轻铺在蔗糖溶液上部，经高速离心2~3 h后，大小不同的RNA分子即分布在相应浓度的蔗糖部位中。

然后依次收集一系列样品，分别在260 nm处测其吸光度，合并同一峰内的收集液，即可得到相应的较纯的RNA。

（2）柱色谱法用于分离RNA的柱色谱法有多种系统，较常用的载体有DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。

混合RNA样品经色谱柱分离后往往是分子量大的先流出来，分子量小的后流出来，采用分步收集的方法可以获得不同分子量大小的RNA。

（3）凝胶电泳法该法是常用的用于分离鉴定DNA与RNA分子混合物的方法。

该方法以琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，利用DNA或RNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，其泳动速度不同，从而达到分离混合物的目的。

2．制备DNA时，生物材料的预处理方法有哪些？
答：将组织捣碎，制成组织匀浆，然后用生理盐水能溶解RNA核蛋白而不能溶解DNA核蛋白的特性，弃掉上清，留下沉淀
任务四酶类药物的生产与质量控制
一、名词解释
1．固定化酶：是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。

酶经过固定化后，能够在一定的空间范围内进行催化反应，但是由于受到载体的影响，酶的结构发生了某些变化，从而使酶的催化特性发生改变。

2．酶的非水相催化：酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化，包括有机介质，气相介质，超临界流体介质，离子液介质。

3．模拟酶：用人工方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物叫人工模拟酶，简称人工酶或模拟酶。

它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上相对天然酶简单。

二、填空题
1．生物提取分离法生物合成（转化）法化学合成法
2．选取符合要求的动植物材料生物材料预处理提取纯化
3．交联法结合法包埋法吸附法热处理固定化
4．离子键结合法化学键结合法
三、问答题
1．生物提取法制备药用酶时要注意哪些方面？
答：①防止酶蛋白变性为防止酶蛋白变性，保持其生物活性，应避免高温，避免pH过高或过低，一般要在低温（4 ℃左右）和中性pH下操作。

为防止酶蛋白的表面变性，不可激烈搅拌，避免产生泡沫。

应避免酶与重金属或其他蛋白变性剂接触。

如要用有机溶剂处理，操作必须在低温下短时间内进行。

②防止辅助因子流失有些酶除酶蛋白外，还含有辅酶、辅基和金属等辅助因子。

在进行超滤、透析等操作时，要防止这些辅助因子的流失，影响终产品的活性。

③防止酶被蛋白水解酶降解在提取液尤其是微生物培养液中，除目的酶外，还常常同时存在一些蛋白水解酶，要及时采取有效措施将它们除去。

如果操作时间长，还要防止杂菌污染酶液，造成目的酶的失活。

从动物或植物中提取酶受到原料的限制，随着酶应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已逐渐转向用微生物发酵法生产。

2．酶的生物提取分离过程中的结晶方法有哪些？
答：盐析法，有机溶剂法，复合结晶法，透析平衡法和等电点法
任务五糖类药物的生产与质量控制
一、名词解释
1.单糖：单糖是糖的最小单位，如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。

2.寡糖：又称低聚糖，由2~20个单糖聚合而成。

如蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖。

3.多糖：又称多聚糖，由20个以上单糖聚合而成。

如香菇多糖、右旋糖酐、甘露聚糖、茯苓多糖等。

二、填空题
1.海藻、海带、发酵法、葡萄糖
2.三硫酸软糖、L-艾杜糖醛酸
3.动物软骨、酸性黏多糖、A、C
4.发酵法、酶转化法
5.Seveg法、三氯醋酸法、磷钼酸-磷钨酸沉淀法、高岭土吸附法、三氟三氯乙烷法、等电点法、乙醇沉淀法
三、问答题
1. 糖类药物的类型及生物活性？
答：单糖：葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖；低聚糖：蔗糖、麦芽乳糖、乳果糖；多糖：甘露聚糖、香菇多糖、茯苓多糖。

活性：调节免疫，影响补体活性，促进淋巴细胞增生；抗感染作用：提高机体对细菌、原虫等感染的抵抗力；促进DNA、蛋白合成，促进细胞增殖和生长；抗辐射作用，茯苓多糖、紫菜多糖、透明质酸；抗凝血、降血脂，肝素，硫酸软骨素。

2. 多糖的提取纯化方法有哪些？
答：提取原则：（1）抑制或破坏酶的作用后，才能制取天然存在形式的多糖。

（2）速冻冷藏是保存提取多糖材料的有效方法。

提取方法：（1）根据溶解度性质，用热水提取难溶于冷水和乙醇，易溶于热水的多糖；用稀碱液提取难溶于水，可溶于稀碱的多糖。

（2）大多数黏多糖可用水或盐溶液直接提取，但因大部分黏多糖与蛋白质结合于细胞中，需用酶解法或碱解法裂解糖-蛋白间的结合键，促使多糖释放。