固定化酶固定化细胞

固 本低，但生产出来的氨基酸是DL 外消旋体。 定 要想把L-氨基酸分离出来，需要进行光学拆分。 化 酶 外消旋体：对映体的右旋体和左旋体等量混合 固 后，它们的旋光性相互抵消，不再有旋光性。 定 化 这样的混合物称为外消旋体，以D、L表示。 细 外消旋体可以用适当方法拆开或分开。 胞
生 化 外消旋化：在一般情况下，和不对称碳原子 工 程 相连的四个原子或原子团，不能随意调换位 第 置，因此对映体不能相互转换，旋光度维持 七 不变。 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
b. 由于载体的存在，有空间位阻，影响底物 和酶接触，酶的活性得不到全部表达。 细胞固定化后，一般酶活力不下降。细胞内 酶受细胞膜、壁的保护。
生 化 工 固定化酶结构的改变 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残 留酶，易纯化，产品质量高； ③反应条件易控制； ④酶的利用效率高； ⑤比水溶性酶更适合于多酶反应；
生 化 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
生 化 固定化酶生物反应器 工 程 实际应用中，固定化酶可以装在反应器中，
生物工程专业课程 2、稳定性 酶或细胞被固定化后，由于载体的存在，酶 分子的结构或细胞被约束，对外部恶劣环境 的敏感性下降，使其稳定性增加（对热、对 各种化学试剂等）。而且有时稳定性增加的 幅度比较大。
生 化 3、催化特征 工 程 a.底物专一性：当底物为大分子时，酶或细胞 第 对底物专一性下降；当底物为小分子时，酶 七 或细胞对底物专一性变化不大。 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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一个实例。各种光学活性氨基酸都用这种方 固 法生产。该项技术成功的关键是制造出适合 定 化 于工业化要求的固定化酶。
酶 固 定 化 细 胞
生 化 果葡糖浆的生产 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化 工 程 葡萄糖不能直接代替蔗糖，因甜度不够，但 第 葡萄糖和果糖是同分异构体，葡萄糖可以异 七 章 构为果糖。 固 定 化 酶
固定化酶的表观Km(app)与游离酶的Km相比 固 定 有些不变，有的 变化很大。
化 酶 固 定 化 细 胞
生 化 原因可能是：载体间的静电作用，以及扩散 工 程 效应。如果固定化酶区域的底物浓度比外部
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m 第 七 埋法的固定化酶的Km(app)值，可较游离酶多 章 两个数量级。这是由于凝胶中的扩散效应使
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葡萄糖 果糖葡萄糖
葡萄糖异构酶
(高果糖浆)
高果糖浆的甜味是蔗糖的2倍。 固 定 这一应用是目前世界上使用固定化酶规模最 化 大的生产上的实例。
细 胞
生 化 L-苹果酸的生产： 工 程 第 p85 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
酶，能连续进行反应，反应后的酶可回收重 复使用； 概念发展 “水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme) 1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固 定化酶（immobilized enzyme)”
生 化 工 固定化酶的特点 程 具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的 第 功能。 七 ①可多次使用； 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
吸附法在一个使用沸石吸附固定硝化细菌的系统
生 化 工 概述 程 第 七 章
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固 定 化 酶 1969出现了固定化酶技术。 固 固定化酶就是把原来游离的水溶性酶，固定于 定 某一局部的空间或者固定于载体上。 化 细 胞
酶催化剂的优点： 专一性强，反应条件温和，反应速度较快。 弱点： 溶液酶在反应后，分离困难，重复利用困难； 溶液酶稳定性差，易失活。
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生 化 工 程 第 七 章
生物工程专业课程 酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。 优点： ①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电 极的高灵敏度； ②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性， 能够直接在复杂试样中进行测定。
固 定 化 酶 1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄 固 糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结 定 合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖 化 细 氧化酶电极。 胞
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消血栓： 纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反 应，无法长期使用。 酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊 端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由 进出。
生 化 人工肾： 工 程 原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨， 第 再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶 七 囊活性炭组成人工肾。 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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固 固定化时，活性中心的必需基团应避免参加反 定 化 应；避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐 酶 的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键 固 维系的酶蛋白质的高级结构。尽可能在温和条 定 件下进行固定化反应。 化 细 胞
生 化 固定化方法： 工 程 载体结合法；交联法；包埋法；其他方法； 第 载体结合法：将酶（细胞）固定在不溶性载 七 体上。靠共价结合、离子结合、和物理吸附。 章
生 化 工 1973年，日本首次在工业上成功应用固定化 程 大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二 第 酸连续生产L-天门冬氨酸。 七 章 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤 固 酒和酒精； 定 1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀 化 粉酶，开始了固定化细胞产酶的先例。 酶 固 定 化 细 胞
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第 连续生产有利于生产的自动化，提高生产率。 七 鉴于此，70年代以来，该技术受到各国学者 章 的瞩目，纷纷开展固定化酶的研究。 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
生 化 工 第一节 酶、细胞的固定化方法及固定化后的 程 性质 第 七 一、固定化的原则和方法 章 酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心。
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常用的载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖等多 固 定 糖衍生物颗粒或多孔玻璃等。
化 酶 交联法：使酶与具有两个以上官能团的试剂 固 （如：戊二醛）进行反应，应用化学键把酶 定 固定。 化 细 胞
生 化 包埋法：将酶包在凝胶微小格子内，或是将 工 程 酶包裹在半透性聚合物膜内的固定化方法。 第 常用的凝胶为聚丙烯酰胺、海藻酸钙、胶原、 七 卡拉胶等。 章 包埋法简单，可适用于大多数酶。 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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收率高。
氨基酰化E DL-R-CHCOOH + H2O L-R-CHCOOH + D-R-CHCOOH 不对称水解 NH2 NH2 NHCOR′ 溶解度小 酰化-DL-aa L-aa 酰化D-aa
外消旋化
生 化 固定化酶光学拆分DL-氨基酸生产流程 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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3.固定化酶或细胞可重复使用，减少了浪费； 固 定 4.易实现自控 化 …
细 胞
生 化 应用实例：DL-氨基酸的光学拆分。 工 程 人体只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸在食品
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第 医药领域的应用非常广泛，并且需要量不断增 七 加。 章 化学合成法是生产氨基酸的方法之一，该法成
生 化 工 程 第 七 章 固 定 化 酶
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半透膜 酶胶层
感应电极
酶电极示意图
ß -D-葡萄糖＋O2→D-葡萄ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ酸-1,5-内酯＋H2O2 固 定 化 根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和 细 H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电 胞 极来测定葡萄糖的含量。
生 化 工 生物传感器(酶传感器)原理 程 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等） 第 和物理转换器相结合所构成的分析仪器。 七 章 生物识别元件是酶、抗原(体)、细胞器、组织 固 切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形 定 成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性 化 的分子识别能力。 酶 固 换能器将识别元件上进行的生化反应中消耗 定 或生成的化学物质，或产生的光或热等转换 化 细 为电信号，并呈现一定的比例关系。 胞
固 固定化酶的形状 定 ⑴颗粒状固定化酶； 化 ⑵纤维状固定化酶； 酶
⑶膜状固定化酶； 固 定 ⑷管状固定化酶；
化 细 胞
生 化 二、 固定化酶、细胞的性质 工 程 1、固定化后的活性 第 酶经固定化后，活力降低。 七 章 原因是：
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固 a. 酶和载体结合时，活性中心的氨基酸也或 定 多或少地参与了结合 ，使得酶的结构发生部 化 分变化，酶活力有一部分丧失。 酶 固 定 化 细 胞
固定化 酶柱子
离心机
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A-L-Ala
A-D-Ala
泵 储
罐
消 旋 反 应 器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
生 化 1969年，日本，千钿一郎成功地利用固定化 工 程 酰化氨基酸水解酶，由酰化-DL-氨基酸连续 第 生产L-aa获得成功。 七 这是世界上固定化酶在工业生产上应用的第 章
液相主体溶液高，K (app)下降。相反，用包
固 底物浓度减少，导致内部底物浓度低于外部 定 区域的浓度，K (app)上升。 m 化 酶 对于固定化细胞，情况类似。 固 Vmax 一般不变化。 定 化 细 胞
生 化 第二节 固定化酶、固定化细胞的应用 工 程 在上世纪70年代初，出现固定单一的酶，催 第 化单一反应； 七 章 随后同时固定两种酶或两种以上的酶，以及 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
生 化 工 发展历史 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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1953年，德国，Grubhofer、Schleith，聚氨基 苯乙烯树脂为载体，重氮法； 1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基酰化 酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次 工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一 个独立的学科从发酵工程中脱离出来； 1971年，第一次国际酶工程会议确定固定化 酶统一英文名称为Immobilized Enzyme。
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固定化酶和辅酶，催化复杂一些的反应； 再后来发展起来的固定化细胞技术，使得不 易提取的不稳定的酶的利用有了方便条件， 还可以利用活细胞的完整代谢体系来完成复 杂的反应，如乙醇的生产。
生 化 工 在固定化酶、固定化细胞的研究中发展起来 程 的亲和层析技术，已经远远超出了 利用酶和 第 微生物进行催化反应的范畴。例如抗体抗原 七 的提纯是利用了特异的免疫吸附反应。 章 固 固定化酶和细胞技术的显著特点：p80 定 1.连续反应； 化 2.获得的产物纯度高； 酶
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生 化 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化 工 程 第 七 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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生 化 固定化方法与载体的选择依据 工 程 ⑴固定化酶应用的安全性； 第 七 ⑶固定化的成本； 章
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⑵固定化酶在操作中的稳定性；
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b.最适pH：依固定化载体与酶分子、细胞上 所分布电荷的相互作用不同而异。有的变化， 有的不变化，有的向pH小的方向移动，有的 向pH大的方向移动。
生 化 c.反应的最适温度 工 固定化酶、细胞的最适温度往往升高，升 程 第 七 d.动力学常数 章
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高的幅度不同，2~15 ℃不等。
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1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成 功； 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生 产谷氨酸。
生 化 固定化酶： 工 程 酶的固定化：将酶和菌体与不溶性载体结合 第 的过程； 七 固定化酶：在一定空间内呈闭锁状态存在的 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞
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但在热、光、或者化学试剂的影响下，不对 称碳原子上的原子或原子团可发生调换现象， 使旋光物质转化为它的对映体，最后得到外 消旋体，原来100%的左旋体，经变化后，变 成50%左旋体和50%的右旋体，这种现象称为 外消旋化。
生 化 DL-氨基酸光学拆分中，以酶法最佳，它是利 工 程 用酰化氨基酸水解酶，制备纯度高的L-aa，且 第 七 外消旋体 章 固 定 化 酶 固 定 化 细 胞