雉鸡微卫星多态性分析

雉鸡微卫星多态性分析
邢磊1赵乐乐1袁红艳2张春华2陆雪林1*
1.上海市动物疫病预防控制中心，上海201103；
2.上海欣灏珍禽育种有限公司，
上海201408摘要
利用高通量测序等手段开发了8个具有多态性的微卫星标记（ZLL-12、ZLL-14、ZLL-30、ZLL-37、
ZLL-55、ZLL-56、ZLL-61、ZLL-68），以期从分子水平上研究雉鸡的遗传多样性，为雉鸡种质资源遗传多样性研
究、基因定位以及分子标记辅助育种提供分子水平上的有效工具。

试验结果显示：RN 群体中，观测等位基因数平均为5.38，每个位点从1（zll-12）到9（zll-30和zll-68）不等，有效等位基因数平均为3.64；MX 群体中，观测等位基因数平均为5.75，每个位点从2（zll-12）到10（zll-68）不等，有效等位基因数平均为3.65；D 群体中，观测等位基因数平均为5.13，每个位点从2（zll-12）到11（zll-30）不等。

8个位点在RN 、MX 、D 3个群体中，除zll-12、zll-61的PIC 小于0.5外，其余6个位点的PIC 值均高于0.5。

关键词微卫星多态性；雉鸡；高通量测序
收稿日期：2019-12-12
基金项目：上海市科技兴农重点攻关项目（2017-02-08-00-12-F00069）*通讯作者
邢磊，男，1996年生，助理畜牧师。

微卫星（SSR ）标记技术对加快畜禽性状选育有很大的优势[1]，
关于雉鸡的分子标记研究以前尚未有过，而且雉鸡的基因组信息也是未知的。

因此，
本
研究利用高通量测序技术以雉鸡基因组为研究对象对雉鸡的SSR 分子标记进行开发，构建出雉鸡
SSR 分子标记数据库，迈开了进行雉鸡分子标记遗传研究的第一步。

通过设计特异性引物并经过样本群体的多态性验证[2]，得到了可靠的多态性SSR 标
记，旨在为雉鸡种质资源遗传多样性研究、基因定位以及分子标记辅助育种提供分子水平上的有效工具[3]。

1材料与方法
1.1试验动物
试验动物来源于上海欣灏珍禽育种有限公司饲养的中华环颈雉（RN ）、蒙古雉（MX ）和国内雉鸡
（D ）的纯种后代。

3个品种在同一鸡舍、相同管理条件下饲养。

1.2血液样本采集及基因组提取
第20周时，从试验群体中随机挑选105只母
鸡采集血样，各样本翅静脉取血3mL ，4%EDTA 抗凝剂抗凝，-20℃保存。

利用试剂盒法（天根生化
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（DP318）血液基因组提取试剂盒）提取血样基因组，采用TBS380结合picogreen进行浓度和纯度检测，再根据浓度检测结果利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA的完整性，电压120V，时间20min。

所得DNA于-20℃储存备用。

1.3微卫星标记的引物设计及筛选
通过454平台高通量测序，利用MISA程序在序列中搜索SSR位点，利用primer3_2.2.3对搜索得到的SSR位点设计特异性引物。

扩增目标片段为重复序列前1个碱基到后5个碱基的片段，扩增产物长度在100~400bp之间。

设计引物时，遵循一般的引物设计原则，并对PCR产物长度及范围、引物退火温度范围、GC含量、长度等进行严格限定，从而进行相关参数的调整。

然后选择分布均匀的SSR位点通过90个样本逐级PCR反应筛选多态性位点。

PCR反应体系总体积为20μL，其中ddH2O14μL，10×Buffer2μL，DNA模板1μL，上、下游引物各0.50μL，dNTP0.5μL，Taq酶0.5μL。

PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

1.4微卫星标记的基因型判定及数据分析
利用确定的8对多态性SSR设计荧光引物上ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，进而进行基因型判定并进行数据分析。

用POPGENE3.2统计观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）等。

多态信息含量（PIC）用软件LittlePrograme计算。

2结果与分析
经过逐级多态性验证，最终确定8条多态性SSR序列，具体信息见表1。

8对微卫星在所有雉鸡个体中均能成功扩增。

观测等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度见表2，多态信息含量见表3。

由表2可知，RN群体中，观测等位基因数平均为5.38，每个位点从1（zll-12）到9（zll-30和zll-68）不等，有效等位基因数平均为3.64。

MX群体中，观测等位基因数平均为5.75，每个位点从2（zll-12）到10（zll-
68）不等，有效等位基因数平均为3.65。

D群体中，观测等位基因数平均为5.13，每个位点从2（zll-12）到11（zll-30）不等，有效等位基因数平均为3.45。

对8个微卫星标记群体杂合度计算结果（表2）显示，RN 群体平均观察杂合度、期望杂合度、Nei期望杂合度分别为0.60、0.60、0.59；MX群体平均观察杂合度、期望杂合度、Nei期望杂合度分别为0.60、0.62、0.61；D群体平均观察杂合度、期望杂合度、Nei期望杂合度分别为0.56、0.61、0.59。

根据表3统计结果可知，8个位点在RN、MX、D三个群体中，除zll-12、zll-61的PIC小于0.5外，其余6个位点的PIC值均高于0.5，说明所选取的位点大多为高多态位点（图1）。

zll-30与zll-68的多态信息含量在3个群体中均较高，zll-30在D群体中多态信息含量达0.89，zll-68的多态信息含量在3个群体中均超过了0.83。

3讨论
因为国内雉鸡品种（D）和由美国引进的原种雉鸡2个品种中华环颈雉（RN）和蒙古雉（MX）属于同一物种，因此从3个品种中随机选择国内雉鸡品种（D）的1个样本进行高通量测序，从而得到雉鸡所拥有的SSR位点。

雉鸡并没有基因组序列和注释信息可进行参考，只能按照无参考基因组序列的物种进行SSR分子标记的开发，然后通过PCR和一代测序试验验证方法筛选出可用的SSR分子标记。

针对未知基因组信息的雉鸡群体，采用454测序平台
表1多态性SSR引物信息
引物名称引物长度/bp上游引物（5'-3'）Tm/℃下游引物（5'-3'）
ZLL-12234ACAGCTGCTCCTTCCATTGT60AACTGCCCGATGAACTTGAC
ZLL-14346ACATCCAAGTGCCTACGGTC60GTGCCCCATAGATCATGTCA
ZLL-30224AGCCCCTCAGTGACTACAGC60CAGGCCCTACCTGCATTAGA
ZLL-37217AGGCTTGAAAGAGTGGGCTT60ATGGGCAGTTTCATCCACTC
ZLL-55273CAACAGGAGCAACAGCGATA60ACGGTGATTCTTATCCGTGC
ZLL-56348CAACTGCATCGTCCTCAGAA60GGTCCCAGCTACGAAATGAA
ZLL-61318CAGGAGTGAACGTTGCAGAA60GCCCAGACTGCCTTAAACAA
ZLL-68339CCAACCCAACGCAAGATAAT60TGGATTGCTAGCAGGGTAGG . All Rights Reserved.
结合SSR 富集文库测序的高通量测序方法进行雉鸡SSR 分子标记的开发，很好地解决了近缘物种引物交叉扩增所带来的无PCR 产物的高风险，而且
454平台能够提供足够的侧翼序列用于特异性PCR
引物设计[4]。

SSR 富集文库的构建能够减少测序数据量，降低测序成本，提高开发效率，
分析手段目标位点类别
RN
MX
D
ZLL-120.000.060.18ZLL-140.760.760.68ZLL-300.850.780.89ZLL-370.540.550.51ZLL-550.770.80.62ZLL-560.690.660.62ZLL-610.340.460.48ZLL-680.840.870.83Mean
0.600.620.60St.Dev 0.300.260.22表3
雉鸡群体的多态信息含量
表2雉鸡群体的等位基因数和杂合度
类别
位点等位基因观察数
有效等位基因数目
平均观测杂合度
期望杂合度
Nei 期望杂合度
RN
ZLL-1211
ZLL-14
5
4.450.860.790.78ZLL-30
9
6.87
0.97
0.87
0.85
ZLL-37
3
2.13
0.52
0.54
0.53
ZLL-55
7
4.23
0.76
0.78
0.76
ZLL-56
6
3.17
0.62
0.70
0.68
ZLL-613
1.33
0.28
0.25
0.25
ZLL-689
5.99
0.83
0.85
0.83
Mean
5.38 3.64
0.600.60
0.59
St.Dev
2.92 2.13
0.330.32
0.31
MX
ZLL-12
2
1.07
0.07
0.07
ZLL-14
5
4.05
0.69
0.77
0.75
ZLL-30
9
4.78
0.90
0.80
0.79
ZLL-37
3
2.09
0.59
0.53
0.52
ZLL-55
9
4.75
0.79
0.80
0.79
ZLL-56
5
2.99
0.69
0.68
0.67
ZLL-613
1.71
0.28
0.42
0.42
ZLL-6810
7.75
0.90
0.89
0.87
Mean
5.75 3.65
0.600.62
0.61
St.Dev
3.15
2.16
0.320.27
0.27
D
ZLL-12
2
1.26
0.21
0.20
ZLL-144
3.55
0.77
0.73
0.72
ZLL-3011
8.45
0.85
0.90
0.88
ZLL-37
3 1.91
0.62
0.49
0.48
ZLL-55
5
2.50
0.58
0.61
0.60
ZLL-56
6
2.47
0.69
0.60
0.59
ZLL-613
1.82
0.27
0.46
0.45
ZLL-687
5.63
0.73
0.84
0.82
Mean
5.13
3.45
0.56
0.61
0.59
St.Dev
2.90
2.43
0.29
0.22
0.22
图1三个群体中8个微卫星位点PIC
含量分布
. All Rights Reserved.
更明确、更经济、快速、高效，也为研究其他未知基因组信息的物种的分子标记提供了思路和方法。

有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀[5]。

本研究中8个微卫星标记在雉鸡群体中有效等位基因数最小为1，最大为8.45，反映出8个微卫星标记的等位基因在群体中分布不均匀。

基因杂合度被认为是度量群体遗传变异的最适参数。

杂合度越低，表明该群体遗传一致性越高，遗传多样性也越低[6]。

对于分子遗传标记，Helentjaris等[7]提出用多态信息含量值（PIC）衡量基因变异程度高低、反映遗传信息的多少。

多态信息含量是等位基因频率和等位基因数的变化函数。

当位点PIC>0.5时，该位点为高度多态位点；当位点0.25<PIC<0.5时为中度多态位点；当PIC<0.25时为低度多态位点。

zll-30与zll-68的多态信息含量在3个群体中均较高。

多态信息含量（PIC）和遗传杂合度（He）都是表示群体内遗传变异的指标。

从保种的角度来考虑，我们要保持品种的遗传多样性，只有PIC和He数值大，才能说明群体遗传多样性比较丰富。

所以，由表2和图1可知，本研究所选雉鸡群体的遗传多样性非常丰富，这与雉鸡的实际繁养情况相符合。

因为国内雉鸡养殖长期处于散养状态，并且没有受到高强度的选择。

4结论
在雉鸡生产中，雉鸡羽色、颈环大小、产蛋性能等都是影响雉鸡企业经济效益的重要因素。

采用传统育种与分子标记结合的选择育种，可有效提高雉鸡生产的经济效益。

本研究利用8对微卫星标记对雉鸡群体进行多态性检测，旨在为下一步指导雉鸡分子育种提供科学依据和数据支撑。

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养猪巧用小苏打
1）消除黄曲霉。

将100kg玉米浸入200kg1%的小苏打溶液中，10h后捞出，然后用清水冲洗干净，即可消除玉米中的黄曲霉。

2）促猪快长。

养猪时，添喂小苏打可补偿赖氨酸不足，对猪有增进食欲、帮助消化、调节体内酸碱平衡等作用。

仔猪日粮中添加0.5%小苏打，能提高仔猪采食量，日增重10%；育肥猪每头每天加
喂小苏打3~4g，饲料消耗可降低13%；屠宰前，给猪口服小苏打，可延迟屠宰后猪肉的pH值下降，
提高肉质。

3）防止黄白痢。

产后哺乳母猪日粮中添加2%的小苏打，可增强母猪体质，防止仔猪黄、白痢的发生，提高仔猪成活率5%。

对患黄痢、红痢和白痢的仔猪，饮用口服补液盐溶液（配方是小苏打2.5
g、氯化钠3.5g、氯化钾1.5g、葡萄糖20g，加温开水1000mL），药液现用现配，一天多次，能增强
仔猪的抗病力，提高仔猪成活率10%。

来源：陕西农村报. All Rights Reserved.。