高效液相色谱法

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3)极性键合相
常用氨基、氰基键合相。 可用作正相色谱得固定相,洗脱剂常用
非极性或弱极性溶剂,加入适量得极 性溶剂,以调节洗脱强度。 极性小得先出峰,极性大得后出峰。
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正相色谱常用固定相结构
氰 基
-(CH2)3C=N
氨 基
-(CH2)nNH2 (n=3 or 4)
二 醇
-(CH2)3OCH(OH)CH2OH
等。
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反相色谱得特点
A 适于分离带有不同疏水基团得化合物。 B 可通过改变溶剂组成与pH,来分离不同极
性得化合物。 C 可分离从极性到非极性得宽范围得化合物。
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正相色谱得应用
正相色谱适用于分离极性化合物。如:酚 类、胺类、多环化合物、染料、炸药、羟 基化合物、氨基酸与药物等。这些样品在 正己烷或其它烷烃溶剂中得溶解度很小, 在极性溶剂中得溶解度良好。用正相色谱 分离可得到较好得效果。
2)装柱要求 均匀紧密、不破坏颗粒、不形 成裂缝 、颗粒粗细不可分级
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3、色谱柱柱效得评价
最小理论塔板数 n＞104 分离度R≥1、5 拖尾因子 f =0、95-1、05 相对保留值得再现性
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4、 色谱柱得保 养
注意流动相得纯化 防止堵塞与污染 柱得操作压力＜装填柱得压力 应该用进样阀进样 防止柱得反冲 贮存色谱柱时应防止干涸 使用保护(预)柱
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大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
液-固吸附色谱固定相
HPLC固定相主要用硅胶。
(1)无定形全多孔硅胶 : YWG ( 2)球形全多孔硅胶:YQG (3)堆积硅珠:YQG
高分子多孔微球:YSG
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化学键合相色谱固定相
将固定液得官能团键合在载体得表面 而构成化学键合相。
以化学键合相为固定相得色谱法称为 化学键合相色谱法(BPC),简称键 合相色谱法。
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规律 ①组分分子结构对保留值得影响:组分得保留
值与其分子中非极性部分得总表面积越大, 保留值也越大。 ②烷基键合相得特性对保留值得影响:随碳链 得加长,组分得保留值增加,对组分分离得选 择性也增加。 ③流动相性质对保留值得影响:流动相得表面 张力越大、介电常数越大,其极性越强,流动 相得洗脱强度越弱,组分得保留值越大。
使用过程不流失,耐溶剂冲洗 化学性质稳定,柱子不娇 热稳定性好 载样量大 适用于梯度洗脱
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化学键合相得类型
全多孔硅胶为基体 键合相得表面结构:
单分子键合 Si-O-C, Si-O-Si-C 聚合键合 Si-O-Si-C
结合得化学键类型: Si-O-C、Si-N、Si-C、Si-O-Si-C
极性:非极性、中等极性、极性
示差折光检测器(RID) 电化学检测器(ECD) 红外检测器 介电常数检测器 放射性检测器 MS检测器 NHM检测器
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高效液相色谱条件选择
提高柱效方法
1、柱内展宽
H A B / u (Cm Csm Cs )u
涡流扩散项A 纵向扩散项B/u 提高柱效方法 流动得流动相得传质阻力项Csmu 静态流动相得传质阻力项Csmu 固定相得传质阻力项Csu 2、 柱外展宽
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HPLC特点 三高、两广、一少
高效化、高速化、高灵敏度 分析范围广、流动相选择范围广 样品用量少 色谱柱可反复使用、流出组分易
收集、安全
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HPLC类型
按实验目得 分析型(ϕ1～6:4、6、2、1 mm) 制备型(ϕ10～500mm)
按分离机制
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按分离机制
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HPLC类型
反相键合相色谱法 反相离子抑制色谱法 反相离子对色谱法 手性色谱法 亲与色谱法
电化学(ECD)
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通用型检测器
蒸发激光散射检测器(ELSD) 示差折光检测器(RID) 质谱检测器(MS)
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(1)紫外检测器(UVD)
1)原理:被测组分对指定波长得紫外 光得选择性吸收 固定波长型
2)类型 可变波长型 扫描型 光电二极管阵列(DAD)
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3)特点:灵敏度高、噪音低;不破坏 样品、能与其她DET串联,可用于 制备 ;对温度及流动相流速波动 不敏感,可用于梯度淋洗
高效液相色谱法
HPLC法以经典LC为基础,引入GC得 理论与技术,并加以改进而发展起来得 一种分离分析方法。
就是色谱法得一个重要分支,以液体 为流动相,用高压输液系统,将流动相泵 入色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入 检测器进行检测,从而实现对试样得分 析。
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【示例10-1】
现行《中国药典》二部阿司匹林片剂得含量 测定。
4)弱点:只能检测有UV吸收得样品; 流动相得选择有一定得限制
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(2)蒸发光散射检测器(ELSD)
1)原理:粒子对光得散射 2)组成:喷嘴、漂移管、光电管 3)定量依据:E=Kmn
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(3)荧光检测器
1)原理:物质分子得荧光吸收 2)优点:固有得灵敏度与选择性 3)缺点:应用不广泛
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(4) 其她检测器
(4) eo得特点 溶剂强度与溶剂得体积百分比不成
线性关系。
(5) 含水量得控制 通过有机修饰剂得调节,控制硅 胶得含水量。
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反相色谱流动相
注意: A 缓冲离子不能产生沉淀。 B 溶剂得紫外切点必须小于所使用得
检测波长。 C 避免使用卤族离子。 D pH 调节在2~7、5之间。不能超过7、
104 -106 /m
柱长
1-2m
10-25cm
柱内径 2-5cm
0、2- 0、
5cm 5
不同点: LC
样品用量 分析时间 装置
1-10g 长 1-20h 间断 非仪器 精度低
HPLC
10-6 - 10-2g 10-几十min 连续、自动化
仪器化 精度高
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10、1 高效液相色谱法类型 10、2 常用固定相与流动相 10、3 高效液相色谱仪 10、4 高效液相色谱条件选择 10、5 应用与实例
5,否则硅胶将被溶解！
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反相色谱得流动相
最常用:水、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、 四氢呋喃等。
主要组成就是水,极性与表面张力最高,最弱 得流动相,以此洗脱非极性组分时,表现出得 滞留时间最长。
甲醇与乙腈,就是最常用得调节剂。(因为甲 醇与乙腈得紫外切点相对较低,且粘度较小, 及易于提纯。)
规律:水量越高,保留时间越长。
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正相色谱得流动相
正相色谱得流动相最常用得就是烷 烃溶剂。如:正戊烷、正己烷、正庚 烷、环已烷等。
流动相得极性越强洗脱能力越强,也 就就是强溶剂。反之为弱溶液剂。
液-固色谱得应用
(1) 主要用于脂溶性化合物得分离:如磷脂、甾 体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等。
(2) 分离几何异构体: 如维生素A得几何异构体。
在使用正相色谱时一个值得注意得问题 就是在用氨基作固定相分离糖时,一些还 原糖容易与固定相得氨基发生化学反应, 产生席夫碱(Schiffsbase)。
10、3 HPLC色谱仪
HPLC仪组成 主要部件及功能
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HPLC仪组成
高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
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HPLC 得组成及工作流程
观察有无漏液
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(二)进样针
➢ 手动 高压进样阀 注射器进样
➢自动 自动进样器 圆盘式自动进样器 链式自动进样器
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六通阀手动进样器
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(Load)
(Inject)
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(三)色谱柱
色谱柱由柱管与固定相组成。 对柱得要求: 承受高压、对流动相呈化学惰
性、对样品得Rs大柱容量大、 分析速度快
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化学键合相得形成
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性能指标
1)覆盖率 指参与反应得硅醇基数目占硅胶表面硅
醇基总数得比例。 覆盖率得大小决定键合相就是分配还就
是吸附占主导。 (2)含碳量(C%)
表示键合相得键合量,与键合反应及表面 覆盖率有关。 高碳、中碳及低碳型
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特点
机理:吸附&分配
化学键合相色谱法(BPC) 化学键合相得优点:
色谱条件:用十八烷基键合硅胶为填充剂;以 乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水(20:5:5:70)为流动 相;检测波长为276 nm。
取片剂20片用1%冰醋酸-甲醇溶液精密制成 100 mL,精密配制阿司匹林0、l g/L对照品溶 液,分别精密取供试品与对照品溶液10 μL,进 行测定。
按外标法以峰面积计算,即得。
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HPLC与经典LC得比较
相同点:均有四种色谱机理
液固吸附色谱 (HPLSC)
液液分配色谱 (HPLLC)
离子交换色谱 (HPIEC)
凝胶色谱
(HPGPC)
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不同点: LC
HPLC
固定相 全多孔
表面多孔型得
无定型
全多孔微粒
粒度 不均匀不耐高压 均匀耐高压
操作压力 常压、低压
高压
柱 效 10-100/m
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1)非极性键合相:
表面基团为非极性烃基,C18、C8、甲 基、苯基等,用作反相色谱得固定相。
最常用得非极性键合相就是十八烷 基键合相(ODS键合相),洗脱剂多为 强极性溶剂,如水、醇、乙腈或无机 盐缓冲液。
常用CH3OH—H2O作流动相,极性大 先出峰,极性小后出峰。
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反相色谱常用得微粒键合相
二甲氨基 -(CH2)3N(CH3)2
二 氨 基 -(CH2) 3NH(CH2)2 NH2
常用流动相及其选择
选择流动相: (1)化学性质稳定。 (2)粘度小。 (3)溶剂得纯度要高。 (4)沸点低(制备型)。 (5)与色谱系统得适应性好。
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液固色谱流动相 选择原则 极性大得试样用极性强得洗脱剂 极性小得试样用极性弱得洗脱剂 洗脱剂得极性强弱可用溶剂强度
➢ 官能团
载体
颗粒直径
➢ 十八烷基 Zorbax
3~10 um
➢ 辛 烷 基 Nucleosil 100A 3~10 um
➢ 苯 基 m porasil
~7 um
➢ 二甲硅烷 Lichrosorb
3~10 um
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2)中等极性键合相
常用得有醚基键合相,既可作正相又 可作反相色谱得固定相,视流动相得 极性而定。
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主要部件
(一)输液泵 (二)进样器 (三)色谱柱 (四)检测器
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(一)输液泵
高压输液系统 泵得类别 对泵得要求 泵得保养
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1、高压输液系统
储液罐 脱气装置
过滤器 高压输液泵
关键
梯度洗脱装置
压力脉动阻滞器
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2、泵得类别
螺旋注射泵 往复柱塞泵 往复隔膜泵 气动放大泵
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3、对泵得要求
(3)分类分离(族得分离):从非极性很强得甾醇化 合物到极性很强得磷脂酸。
一般ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ讲,溶解于有机溶剂得样品可得到最佳分 离,而强极性或离子型样品常常得不到令人满意 得结果。
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反相色谱得应用
可分离极性到非极性得各种化合物。 A 氨基酸、多肽与蛋白质得分离。 B 碱基、核苷与核苷酸得分离。 C 甾体化合物得分离。 D 其它:儿茶酚胺、组胺、糖类、维生素、酶
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1、色谱柱尺寸 2、色谱柱得装填 3、色谱柱柱效得评价 4、色谱柱得保养 5、柱温箱
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1、 色谱柱尺 寸
分析型:Ø 5mm或4、6mm 制备型:Ø＞5mm以上 微径柱:Ø <2mm 柱长:10～25cm,30cm很少见 柱体:直型优质不锈钢柱管
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2、色谱柱得装填
1)方法 干法装柱、匀浆法装柱
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5、 柱温箱
采用循环空气浴 周围环境要保持恒定
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(四) 检测器
对检测器得要求 检测器分类
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1、对检测器得要求
灵敏度高 噪音低 线性范围宽 重复性好 适用化合物得种类广
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2、检测器分类
选择性检测器 ——组分性质检测器
通用型检测器 ——总体性检测器
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紫外( UVD ) 选择性检测器 荧光(FD)
梯度混合仪
温度控制器
记录仪
流动相
高压输液泵
进样装置
色谱柱
检测器
色谱工 作站
1螺旋注射泵 2往复柱塞泵 3往复隔膜泵 4气动放大泵
1自动进样器 2手动进样器
色谱柱 “心脏”
1液固 2液液 3离子交换 4空间排阻
计算机
1紫外检测器 2荧光检测器 3示差折光检测器 4电化学检测器 5电导检测器 6放射性检测器
流量恒定,精密度高±1% 输出压力高,平稳 流量范围宽0、01-10ml/min
制备液相流速较高 耐高压耐腐蚀 泵体易于清洗
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4、泵得保养
如果流动相有酸、碱、盐等缓冲体 系,必须用水冲洗。
如果压力过大,混合器可用6mol/L HNO3超声,再用水超声。
对仪器得拆卸应在仪器负责人或厂 家工程师得指导下进行。
(ε0)参数来衡量; 分离复杂试样,采用梯度洗脱。
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液固色谱中流动相得选择
(1) 强溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力强得溶 剂,洗脱溶质分子得能力也强。
(2) 弱溶剂 与硅胶表面活性位置结合能力弱得溶 剂,洗脱溶质分子得能力也弱。
(3) 结合能eo eo值越大,溶剂为强溶剂。常用:正已
烷、异辛烷、氯仿、异丙醇、乙腈等。