β-地中海贫血基因检测(荧光PCR熔解曲线法20141013下午)
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这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的dna片段扩增数百万倍这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义极大地推动了生命科学的研究进展
β-地中海贫血基因检测
（荧光PCR熔解曲线法）
β 地中海贫血是指β 链的合成受部分或完全 抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故 常用荧光PCR熔解曲线法确定突变类型。我国各 民族的β 地贫基因突变情况有一定差异，南方汉 族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、 IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占 85%～90% 。
3min
40-80 ℃（0.4 ℃ /5s）升温
4.检查结果的判断 ：源自【原理】PCR技术原理
该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷 酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链 DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡 核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结 合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下， DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端， 并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合 成一条新的DNA互补链。而且这种新链又可成为 下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万 倍。
荧光PCR熔解曲线法原理 解链曲线（熔解曲线）： 在连续加热使DNA变性的过程中以温度对 DNA溶液的A260值作图，可得一条“S”形曲线， 称为解链曲线（熔解曲线） 。 解链温度（Tm）： DNA解链曲线中吸光度 值达到最大吸光度值的50% 时的温度称为解链温度， 也称为融解温度。此时DNA 分子中50%的双链被解开。
加入 5ul DNA溶液 反应液B管（做好记号）
总体积25微升
5000rpm，2秒
加入 2.5ul DNA溶液
总体积25微升
PCR扩增条件 50℃， 95℃， 95℃， 55℃， 76℃， 2min 10min 15s 15s 20s 55cycles
3.熔解曲线分析 ： 95℃， 1min
35℃，
荧光PCR熔解曲线法原理
野生型与突变型DNA的碱基组成不同，因此 他们的Tm值和熔解曲线不同，通过比较野生型 与突变型DNA的Tm值和熔解曲线，并与标准Δ Tm
值对照，可以确定β -基因突变型。
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了） 2.PCR扩增 ： 反应液A管（做好记号）
5000rpm，2秒
PCR反应的基本成分包括：
模板DNA(待扩增DNA) 引物 4种脱氧核苷酸(dNTPs) DNA聚合酶 适宜的缓冲液
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的高温变性：93℃双链DNA解离成为 单链 ②模板DNA与引物的低温退火(复性)：引物与模 板DNA单链的互补序列配对结合 ③引物的适温延伸：合成一条新的与模板DNA 链互补链 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握荧光PCR熔解曲线法原理及方法，熟悉其应 用
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。
β-地中海贫血基因检测
（荧光PCR熔解曲线法）
β 地中海贫血是指β 链的合成受部分或完全 抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故 常用荧光PCR熔解曲线法确定突变类型。我国各 民族的β 地贫基因突变情况有一定差异，南方汉 族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、 IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占 85%～90% 。
3min
40-80 ℃（0.4 ℃ /5s）升温
4.检查结果的判断 ：源自【原理】PCR技术原理
该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷 酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链 DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡 核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结 合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下， DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端， 并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合 成一条新的DNA互补链。而且这种新链又可成为 下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万 倍。
荧光PCR熔解曲线法原理 解链曲线（熔解曲线）： 在连续加热使DNA变性的过程中以温度对 DNA溶液的A260值作图，可得一条“S”形曲线， 称为解链曲线（熔解曲线） 。 解链温度（Tm）： DNA解链曲线中吸光度 值达到最大吸光度值的50% 时的温度称为解链温度， 也称为融解温度。此时DNA 分子中50%的双链被解开。
加入 5ul DNA溶液 反应液B管（做好记号）
总体积25微升
5000rpm，2秒
加入 2.5ul DNA溶液
总体积25微升
PCR扩增条件 50℃， 95℃， 95℃， 55℃， 76℃， 2min 10min 15s 15s 20s 55cycles
3.熔解曲线分析 ： 95℃， 1min
35℃，
荧光PCR熔解曲线法原理
野生型与突变型DNA的碱基组成不同，因此 他们的Tm值和熔解曲线不同，通过比较野生型 与突变型DNA的Tm值和熔解曲线，并与标准Δ Tm
值对照，可以确定β -基因突变型。
【操作步骤】
1.DNA获取（已准备好了） 2.PCR扩增 ： 反应液A管（做好记号）
5000rpm，2秒
PCR反应的基本成分包括：
模板DNA(待扩增DNA) 引物 4种脱氧核苷酸(dNTPs) DNA聚合酶 适宜的缓冲液
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的高温变性：93℃双链DNA解离成为 单链 ②模板DNA与引物的低温退火(复性)：引物与模 板DNA单链的互补序列配对结合 ③引物的适温延伸：合成一条新的与模板DNA 链互补链 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
【目的】
1.掌握PCR技术原理及方法，熟悉其注意事项 2.掌握荧光PCR熔解曲线法原理及方法，熟悉其应 用
PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建 立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就 将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取 大量单 一核酸片段的技术在分子生物学研究中 具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学 的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术， 而且在DNA重组与表达、基 因结构分析和功能 检测中具有重要的应用价值。