鲨烯合酶RNAi载体构建及对水稻的遗传转化研究

鲨烯合酶RNAi载体构建及对水稻的遗传转化研究
彭梅芳;甘凤;潘春梅;陈克贵
【摘要】鲨烯合酶(Squalene synthase,SQS)是ABA生物合成途径上游支路的一个关键酶.本研究克隆了406bp的SQS基因片段,将其分别正向和反向插入干扰载体pYLRNAi.5中,经过酶切鉴定证实成功构建了干扰载体pYLRNAi-SQS,通过农杆菌介导法转入水稻品种Kasalath中,PCR初步鉴定获得了20株转基因阳性植株,进一步通过半定量RT-PCR分析,阳性转基因材料与野生型Kasalath相比,OsSQS3都有不同程度的下调,而OSQS7变化不明显.证明转入的SQS基因只对OsSQS3起干涉效果,而对OsSQS7无作用,推测水稻中两个SQS基因可能存在不同的作用机制.本研究为进一步研究水稻中OQS3和OsSQS7各自的生物学功能奠定了基础,同时也为研究SQS调控ABA的生物合成提供了研究材料.
【期刊名称】《西南农业学报》
【年(卷),期】2015(028)004
【总页数】6页(P1413-1418)
【关键词】鲨烯合酶;RNAi;载体构建;遗传转化;水稻
【作者】彭梅芳;甘凤;潘春梅;陈克贵
【作者单位】四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都610061;四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都610061;四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都610061;四川省农业科学院生物技术核技术研究所,四川成都610061
【正文语种】中文
【中图分类】S511
鲨烯是生物合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质的共同前体[1]。

而鲨烯合
酶(Squalene synthase，EC2.5.1.21，SQS)是催化两个分子的法呢基焦磷酸(FPP)缩合产生鲨烯(SQ)的关键酶，由于SQS催化的底物FPP处于类异戊二烯代谢途径中的分支点，因此，调控SQS的活性能够直接影响甾醇、三萜类以及以FPP为前体物的其他类异戊二烯化合物的生物合成。

早在1988年，Vogeli等研究发现在SQS活性得到抑制的同时，某些倍半萜类化合物的生物合成得到增强。

Threlfall等[2]研究结果也证明，利用真菌诱导子处理
烟草的愈伤组织会导致愈伤中甾醇生物合成和积累的减少，同时SQS的活性降低。

Wentzinger等[3]人发现，用鲨烯合酶和鲨烯环氧酶的特异性抑制剂squalestatin-1和terbinafine处理烟草细胞的悬浮系，都能够提高细胞中3-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的酶活性。

张毅等[4]研究发现，转黄花蒿反义SQS的烟草中胆固醇含量降低30%～40%，赤霉素(GA3)含量约提高30%由此看来，通过抑制SQS的活性及甾醇的合成可把一部分碳流从FPP引至类异戊二烯途径中的其他支路以达到促进其他支路的生物合成。

拟南芥法呢基转移酶(farnesyltransferase，ERA1)b亚单位调控ABA信号通路和耐旱性[5]，Wang等研究证明，在拟南芥和芸苔中下调法呢基转移酶AtFTA或AtFTB均能增加ABA的敏感性，提高植物的耐旱性[6～7]。

SQS作为法呢基转移酶的一种是否也具有调控ABA信号通路和调控植物耐旱性的功能，为研究其相关功能，本研究构建了SQS基因的RNA干扰载体，并通过农杆菌介导遗传转化水稻，获得了SQS基因表达明显下调的转基因水稻植株，从而为深入研究水稻SQS 基因的生物学功能及作用机制奠定基础。

1.1 材料
1.1.1 植物材料转化受体为水稻籼稻品种(Oryza sativaL.subsp.indica)Kasalath。

1.1.2 质粒和菌株 RNA干扰所用载体pYLRNAi.5为华南农业大学植物功能基因组与生物技术重点实验室构建[8]，包括玉米Ubiqutin启动子和Nos终止子，其中SacⅠ和HindⅠⅠⅠ酶切位点用于目的片段的第1次连接，MluⅠ和PstⅠ酶切位点用于目的片段的第2次连接。

大肠杆菌菌株DH5α和农杆菌菌株LBA4404均
由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、One Step RNA PCR Kit(AMV)和连接酶均购自TaKaRa公司;限制性内切酶购自Fermentas公司;DNA Marker
购自广州东盛生物科技有限公司;质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、植物RNA提取试剂盒购自天根生化北京科技有限公司;引物及测序均由北京华大基因进行;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法
1.2.1 RNAi干扰载体的构建总RNA的提取及cDNA的合成取玉米幼嫩叶片为实
验材料，液氮研磨，利用植物RNA提取试剂盒提取玉米叶片的总RNA，用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒反转录成cDNA。

第1链的插入根据玉米ZmSQS基因序列(Genbank登录号:NM-001111369)选
取保守的一段序列作为干涉区段(300～500 bp)，设计引物为F-iSQS和R-iSQS，以玉米cDNA为模板进行PCR扩增，将得到的目的条带切胶回收，并用SacⅠ和Hin dⅠⅠⅠ对回收产物进行双酶切处理，同时对干扰载体pYLRNAi.5用SacⅠ和HindⅠⅠⅠ进行双酶切，连接载体和目的片段，得到正向插入的中间载体，命名
为pYLRNAi-SQS-F。

第2链的插入以上述中间载体pYLRNAi-SQSF质粒为模板，用RNAi-MluⅠ-
SQS和RNAi-PstⅠ为引物进行PCR扩增，获得上游带有MluⅠ，下游带PstⅠ
酶切位点的SQS目的片段，并进行双酶切，同时用MluⅠ和PstⅠ对中间载体pYLRNAi-SQS-F进行双酶切，将目的片段和载体进行连接，这样就将SQS反向
插入载体，最终获得干扰载体，命名为pYLRNAi-SQS(图1)。

将干扰载体转入农
杆菌LBA4404中，用于水稻遗传转化。

1.2.2 水稻的遗传转化参照已成功报道的实验方法[9]，用含有pYLRNAi-SQS质
粒的农杆菌菌液浸染诱导2周左右的水稻Kasalath愈伤组织，25℃共培养3 d;将经过共培养的愈伤组织用无菌水洗去多余的菌，转移到筛选培养基上筛选两个循环(约4周，每2周继代1次);将已经经过筛选得到的亮黄色抗性愈伤组织转移到分
化培养基上，在28℃光照培养;将分化出的幼苗转移到生根培养基，在28℃光照
培养2周;将分化苗移栽至光照培养室炼苗大约3～4 d后，移栽至土壤中培育，期间适当浇水。

1.2.3 转化植株在DNA水平上的鉴定水稻植株中本身不带有Hygr抗性基因，但
携带目的基因的外源DNA整合进水稻自身基因组内时，植物表达载体上的Hygr
抗性标记基因同目的基因共整合到水稻基因组内，因此通过PCR检测转基因植株
中是否含有Hygr基因，就可证明是否为转基因再生植株。

采用CTAB法提取分化植株叶片DNA作为模板，使用引物F-Hygr和R-Hygr对分化植株进行PCR鉴定，以相应的重组质粒为阳性对照，野生型Kasalath DNA为阴性对照。

1.2.4 阳性植株在RNA水平上的表达量检测在水稻中，编码鲨烯合酶SQS的基因有2个，分别位于3号染色体(OsSQS3)和7号染色体上(OsSQS7)，通过半定量RT-PCR检测这2个目的基因表达量的变化(引物见表1)，内参基因为18S。

采用天根植物RNA提取试剂盒(TRNzolA+，DP421)提取野生型Kasalath及干扰阳性植株的总RNA，通过NanoDrop分光光度计测得RNA的浓度，调整各
RNA浓度致相同水平，采用TakaRa的半定量one-step RT-PCR试剂盒研究
OsSQS3和OsSQS7在各转基因株系中的表达情况，OsSQS3的引物为FKaSQS3-RT和R-KaSQS3-RT，OsSQS7的引物为FKaSQS7-RT和R-KaSQS7-RT。

反应条件为50℃30 min，94℃2min，然后94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，共30个循环，最后72℃总延伸8 min。

2.1 RNAi干扰载体的构建
以玉米mRNA为模板，以F-iSQS和R-iSQS为引物，采用RT-PCR扩增ZmSQS，获得了上游携带SacⅠ，下游携带HindⅠⅠⅠ酶切位点的特异条带，大小约400 bp(图2-A)，经测序与预期片段相符(423 bp)。

用SacⅠ和HindⅠⅠⅠ双酶切ZmSQS片段，同时对干扰载体pYLRNAi.5用相同的酶双酶切，连接酶切后的载
体和目的片段，即得正向插入的中间载体，经酶切和测序鉴定插入片段正确(图2-B)，并命名为pYLRNAi-SQS-F。

以中间载体pYLRNAi-SQS-F质粒为模板，用RNAi-MluⅠ-SQS和RNAi-PstⅠ
为引物将目的片段再次扩增出，经MluⅠ和PstⅠ双酶切后克隆到经相同酶酶切的中间载体pYLRNAi-SQS-F上，用MluⅠ和PstⅠ可切出约400 bp的目的片段(图2-C)，即完成了干扰载体pYLRNAi-SQS的构建。

2.2 农杆菌介导的水稻遗传转化
将干扰载体转入农杆菌LBA4404中，用于水稻遗传转化。

步骤参照Nishimura[9]等的方法:将消毒处理过的水稻种子接种至愈伤诱导培养基(含2 mg/L 2，4-D)上，约10～15 d后从成熟胚盾片处长出愈伤组织(图3-A)，剥下愈伤组织，切成2～4 mm大小转至新的诱导培养基上进行预培养3 d。

用农杆菌稀释至
OD600=0.06～0.08的菌液(加100μM的乙酰丁香酮AS)浸染愈伤组织，25℃共培养3 d，转移到筛选培养基上筛选两个循环(约4周，每2周继代1次)得到亮黄色的抗性愈伤组织(图3-B)。

将抗性愈伤组织转至分化培养基(含2.0 mg/L KT
+0.02 mg/L NAA)上，分化出水稻苗(图3-C，D)。

将分化出来的小苗转入试管生
根培养基上进行生根(图3-E)，待分化苗长壮后即可炼苗移栽至温室。

2.3 T0代转基因再生植株阳性检测
采用CTAB法提取T0代分化水稻植株叶片基因组DNA，用F-Hygr和R-Hygr为引物对分化植株进行PCR鉴定，以pYLRNAi-SQS质粒作阳性对照，野生型Kasalath DNA为阴性对照，部分PCR扩增产物电泳结果如图4。

24株分化植株中检测出20株阳性植株，阳性率为83%。

通过PCR检测，初步筛选得到了T0
代转基因阳性再生植株。

2.4 T0代转基因植株中SQS基因表达量检测
对T0代转基因阳性植株和野生型Kasalath取样，提取RNA，利用半定量one-step RT-PCR对这2种材料不同株系的OsSQS3和OsSQS7基因表达量进行分析，部分结果如图5所示。

与野生型相比，20株阳性转基因植株中有15株OsSQS3
表达量都表现出不同程度的下调，其中有9株下调非常明显，有趣的是，沉默ZmSQS对OsSQS7表达量影响不明显，在20株阳性植株中仅有4株OsSQS7
表达量微下调，其余变化不明显，有的甚至表达量上调。

证明转入的ZmSQS只
对OsSQS3起干涉效果，而对OsSQS7效果不明显，推测可能只有OsSQS3与
玉米SQS具有类似的活性。

近年来，RNAi方面的研究取得了突破性进展，逐渐成为基因功能研究和基因治疗的重要研究手段。

RNAi是一些小片段双链RNA能够高效特异的阻断生物体内与
之同源序列基因的表达，从而使宿主表现出基因表达下调甚至缺失的表型，RNAi
作为阻止特定基因表达的新技术，应用非常广泛。

而该技术的关键是干扰片段的选择和载体构建，尤其是发夹结构中臂序列的选择，将直接影响基因沉默的效果，一般认为100～500 bp的长度干扰效率最高，而相关研究证明，靶基因片段小于1000 bp都能获得良好的干扰效果[10～11]。

本研究选择了SQS基因5’端406 bp长的特异区域作为干扰区域，获得了非常好的干扰效果。

在酵母和人类中，鲨烯合酶SQS基因都是以单拷贝形式存在。

而在植物中，SQS
基因的存在形式却不固定，比如在绿玉树(Euphorbia tirucalli)[12]、东北红豆杉(Taxus cuspidate)[13]中都是以单拷贝形式存在;而在拟南芥(Arabidopsis thaliana)[14]和光果甘草(Glycyrrhiza glabra)[15]中则存在两种形式的SQS基因，其中在拟南芥中只有SQSl有活性，而SQS2不具有活性;另有报道在人参(Panax ginseng)中分离出3种不同表达形式的SQS基因，并且都具有活性[16]。

目前报道在水稻中有两个基因编码鲨烯合酶SQS，分别位于3号染色体(Os03g0805100，OsSQS3)和7号染色体上(Os07g0200700，OsSQS7)，同源性为76.9%，而玉
米SQS基因，与水稻OsSQS3同源性85.1%，与OsSQS7同源性74.9%。

水稻
中OsSQS3和OsSQS7的生物学功能目前还未见报道，因此对水稻中OsSQS3
和OsSQS7各自的生物学功能的及SQS能否调控ABA信号通路和调控植物耐旱
性的研究具有重要的意义。

本研究创新性地利用玉米SQS基因去干扰水稻中SQS基因，有趣的是，获得的转基因植株只有OsSQS3表达量明显下调，而OsSQS7表达量变化不明显，这个结果说明水稻中可能只有OsSQS3具有与玉米SQS类似的活性，而OsSQS7是否
具有SQS的活性，还需要进一步深入研究;另外，转基因植株的育性、株高等表型是否有变化，OsSQS3下调后是否引起ABA生物合成的变化，这都将是笔者下一步研究的重点。

[1]Pandit J，Danley D E，Schulte G K，et al.Crystal structure of human squalene synthase-A key enzyme in cholesterol biosynthesis[J]. Journal of Biological Chemistry，2000，275:30610-30617.
[2]Threlfall D R，WhiteheadⅠM.Coordinated inhibition of squalene synthetase and induction of enzymes of sesquiterpenoid phytoalexin biosynthesis in cultures of Nicotiana tabacum[J].Phytochemistry，1988，
27:2567-2580.
[3]Wentzinger L F，Bach T J，Hartmann M A.Ⅰnhibition of squalene synthase and squalene epoxidase in tobacco cells triggers an up-regulation of3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase[J].Plant Physiology，2002，130:334-346.
[4]张毅，刘彦，王红，等.转青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草鲨烯合酶基因表达的
影响[J].农业生物技术学报，2005，13 (4):416-422.
[5]Cutler S，Ghassemian M，Bonetta D，etal.A protein farnesyl transferase involved in abscisic acid signal transduction in Arabidopsis [J].Science，1996，273:1239-1241.
[6]Wang Y，Ying JF，Kuzma M，et al.Molecular tailoring of farnesylation for plant drought tolerance and yield protection[J].The Plant Journal，2005，43:413-424.
[7]Wang Y，Beaith M，Chalifoux M，et al.Shoot specific down-regulation
of protein farnesyltransferase(a-subunit)for yield protection against drought in canola[J].Molecular Plant，2009，2(1):191-200.
[8]胡旭霞，刘耀光.植物RNA干涉载体的构建及其在水稻基因表达沉默中的应用[J].分子植物育种，2006，4(5):621-626.
[9]Nishimura A，AichiⅠ，Matsuoka M.A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice[J].Nature protocols，2006，1(6): 2796-2802.
[10]Wesley SV，Helliwell C A，Smith N A，et al.Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing in plants[J]. Plant Journal，2001，27(6):581-590.
[11]Gasparis S，Orczyk W，ZalewskiW，et al.The RNA-mediated silencing of one of the Pin genes in allohexaploid wheat simultaneously decreases the expression of the other，and increases grain hardness [J].Journal of Experimental Botany，2011，62(11):4025-4036.
[12]Uchida H，Yamashita H，Kajikawa M，et al.Cloning and characterization of a squalene synthase gene from a petroleum plant，Euphorbia tirucalli L.[J].Planta，2009，229:1243-1252.
[13]Huang Z S，Jiang K J，Pi Y，et al.Molecular cloning and characterization of the yew gene encoding squalene synthase from Taxus cuspidate[J].Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2007，
40:625-635.
[14]Busquets A，Keim V，Closa M，etal.Arabidopsis thaliana contains a single gene encoding squalene synthase[J].Plant Molecular Biology，2008，67:25-36.
[15]Hayashi H，Hirota A，Hiraoka N，et al.Molecular cloning and characterization of two cDNAs for Glycyrrhiza glabra squalene
synthase[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin，1999，22:947-950.
[16]Kim T D，Han JY，Hye Huh G，et al.Expression and Functional Characterization of Three Squalene Synthase Genes Associated with Saponin Biosynthesis in Panax ginseng[J].Plant Cell Physiology，2011，
52(1):125-137.。