细菌DNA提取方法(新)
细菌dna提取方法
细菌dna提取方法细菌DNA提取方法引言:细菌DNA提取是一项关键技术,它是分子生物学、遗传学和生物工程等领域的基础工作。
准确、高效地提取细菌DNA对于后续的实验和研究具有重要意义。
本文将介绍几种常用的细菌DNA提取方法,旨在提供一些参考,以帮助科研工作者更好地进行相关实验。
一、传统提取方法1. 酚-氯仿法酚-氯仿法是最常用的细菌DNA提取方法之一。
其原理是通过酚和氯仿的不同溶解度,将DNA从其他细胞组分中分离出来。
具体步骤如下:(1)收获培养基中的细菌样本并离心;(2)用生理盐水洗涤细菌样本,去除培养基残留;(3)加入酚-氯仿混合液,破坏细胞膜,使DNA释放到溶液中;(4)离心分离上层的水相和下层的有机相;(5)将DNA从有机相中析出,并用乙醇沉淀。
2. 碱裂解法碱裂解法是一种简单快速的DNA提取方法。
其原理是利用碱性溶液将细胞膜溶解,使DNA释放到溶液中。
具体步骤如下:(1)收获培养基中的细菌样本并离心;(2)用生理盐水洗涤细菌样本,去除培养基残留;(3)加入碱性裂解液,使细胞膜溶解,释放DNA;(4)中和碱性液体,并用乙醇沉淀DNA。
二、商业试剂盒提取方法1. 酶联免疫吸附法(ELISA法)ELISA法是一种基于酶标记的免疫学技术,也可以用于细菌DNA的提取。
该方法利用特异抗体与DNA结合,并通过酶标记的二抗进行检测。
具体步骤如下:(1)将细菌样本孵育在含有特异抗体的孔板上;(2)洗涤孔板以去除非特异性结合物;(3)加入酶标记的二抗,与细菌DNA结合;(4)加入底物并测定酶标记物的活性。
2. 磁珠法磁珠法是一种高效、快速的细菌DNA提取方法。
其原理是利用磁性珠子表面固定的DNA结合剂与DNA结合,通过磁场的作用将DNA从样本中分离出来。
具体步骤如下:(1)将细菌样本与磁性珠子和DNA结合剂混合;(2)使用磁力架将磁性珠子与DNA结合剂捕获;(3)洗涤磁性珠子以去除非特异性结合物;(4)用洗脱缓冲液将DNA从磁性珠子上洗脱。
dna提取的各种方法介绍
1、二苯胺试剂:使用前称取 0.8g 二苯胺(需在70% 乙醇试 剂中重结晶 2 次 ) ,溶于 180 ml 冰乙酸中,再加入 8ml 过氯酸 (60%以上),混匀待用,临用前加入0.8ml 1.6%乙醛溶液,所 配试剂应为无色。 每组需56ml 共需2800ml 2、DNA标准溶液:(须经定磷法确定其浓度)取标准DNA 以0.01N NAOH配成200微克/毫升的标准液。 每组需12ml 共需600ml 3、1.6% 乙醛:取 47% 乙醛 3.4ml,加重蒸水定容至 100ml (放于冰箱中,一周之内可以使用)。 共需70ml 4、 ( 测样品液:准确称取猪脾 DNA 或用紫外分光法中剩下 的DNA液配成10微克/毫升的溶液。 每组需4ml 共需200ml
DNA的提取方法简介
为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常 需要从不同的生物材料中提取DNA.由于DNA 分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适 当的材料提取DNA。 动植物中,小牛胸腺۰动物肝脏۰鱼类精子,植 物种子的胚中都含有丰富的DNA。 微生物中,谷氨酸菌体含7%~10%,面包酵母 含4%,啤酒酵母含6%,大肠肝菌含9%~10%。
也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以 1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于 蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对 DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子 的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取 DNA.
1、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则 为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有 鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于 水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离 酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中, DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
DNA提取方法范文
DNA提取方法范文
材料和仪器:
1.细胞样品(例如细菌、动植物组织)
2. lysis缓冲液(含有蛋白酶、盐、缓冲液等成分)
3.蛋白酶K
4.乙酸混合酚
5.氯仿-异戊醇
6. 同济 Pharmacia GenePure Kit
7.离心管及离心机
8.PCR反应管
9.热水浴
步骤:
1. 取细胞样品加入适量的l 管内,混匀后用200L蛋白酶K
(10mg/Lysis)进行蛋白酶作用,37℃恒温2小时,期间翻转混匀。
2. 加入200L 10mg/ml 乙醚/酚搅匀,室温6分钟。
4.在热水浴中加入异戊醇至70°,10分钟,室温离心后去异戊醇。
5.加入75%乙醇冷冻纯化。
6.给乙醇沫体V100V1/50V离心处理梦泪水,禾端。
7. 加入便直完成cent and Over night 28°。
本方法主要通过蛋白酶作用和有机溶剂的使用来破坏细胞膜和蛋白质,最终得到DNA。
蛋白酶K能够将蛋白质降解,使得DNA得以释放出来。
乙
醚/酚和氯仿-异戊醇的使用则有助于分离DNA、RNA和蛋白质,最终得到
高纯度的DNA。
在DNA提取的过程中,要注意避免DNA受到外界污染,可以在操作台
上使用紫外灯杀菌消毒,同时使用无菌技术进行操作。
此外,选用高质量
的试剂和耗材也是保证实验成功的重要因素。
DNA提取原理和方法
DNA提取原理和方法样本处理是DNA提取的第一步,主要目的是将样本处理成适合提取DNA的形式。
不同的样本需要不同的处理方法。
例如,从动物组织中提取DNA时,可能需要粉碎组织样本,使得细胞更容易破碎,从而释放DNA。
而从细菌培养液中提取DNA时,则需要先离心去除其他细胞组分,然后使用溶解酶破坏细胞壁。
细胞破碎是DNA提取的关键步骤之一、细胞破碎的目的是释放DNA分子,使其能够在后续步骤中被分离和纯化。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解破碎。
机械破碎是使用物理力量(例如,搅拌、磨碎、超声波等)来破坏细胞壁,从而释放细胞内的DNA。
化学破碎是使用化学物质(例如,洗涤剂、酸、碱等)来破坏细胞壁和细胞膜,从而释放DNA。
酶解破碎是使用特定酶(例如,蛋白酶、胰酶等)来降解蛋白质和核酸,从而破碎细胞。
核酸纯化是DNA提取的核心步骤,其目的是将DNA与其他细胞组分(如蛋白质、RNA、杂质等)分离。
核酸纯化的方法有很多种,常见的包括酚-氯仿提取法、离心柱纯化法和磁珠纯化法。
酚-氯仿提取法是最常用的DNA纯化方法之一、该方法先使用酚提取样品中的核酸,然后使用氯仿去除蛋白质。
离心柱纯化法是使用离心管柱进行分离和纯化,其中DNA结合到离心柱上的固相载体上,而其他细胞组分则被洗脱。
磁珠纯化法是使用表面被修饰的磁珠与DNA结合,并使用磁场来分离和纯化DNA。
DNA提取完成后,需要对提取得到的DNA进行测量。
DNA的浓度和纯度测量是判断DNA质量的重要指标。
常用的测量方法包括比色法、荧光分光光度法和凝胶电泳法。
比色法是使用特定的染料与DNA结合,并通过比色读数来测量DNA的浓度。
荧光分光光度法是使用荧光分光光度计来测量DNA与DNA结合染料的荧光强度,进而计算DNA浓度。
凝胶电泳法是将DNA经过电泳分离,然后使用负载荧光染料或核酸染料在凝胶中可视化DNA,从而判断其浓度和纯度。
总之,DNA提取是从生物样本中分离和纯化DNA的重要步骤。
细菌dna的提取实验报告
细菌dna的提取实验报告细菌DNA的提取实验报告引言:DNA(脱氧核糖核酸)是生物体内的遗传物质,携带着生命的基本信息。
对于细菌来说,DNA的提取是研究其遗传特性和进化过程的重要手段。
本实验旨在通过提取细菌DNA,了解其结构和功能。
材料与方法:1. 细菌培养物:选择一种常见的细菌菌株,如大肠杆菌。
2. 细菌培养基:含有必需营养物质的培养基。
3. 细菌培养器具:培养皿、试管、移液器等。
4. 提取试剂:细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、异丙醇等。
步骤:1. 准备培养基:按照说明书将培养基溶解于适量的蒸馏水中,并灭菌。
2. 培养细菌:将细菌菌株接种于培养基中,放入培养器中,在适宜的温度和湿度下培养一段时间,使细菌繁殖。
3. 收集细菌:将培养皿中的菌落取出,转移到试管中。
4. 细菌裂解:向试管中加入适量的细胞裂解缓冲液,用移液器轻轻混合,使细菌细胞破裂释放DNA。
5. 蛋白酶处理:加入适量的蛋白酶K,使其降解蛋白质,避免在DNA提取过程中的干扰。
6. DNA沉淀:向试管中加入等体积的异丙醇,轻轻摇动试管,使DNA沉淀形成。
7. DNA收集:用移液器将DNA沉淀转移到另一个试管中,去除异丙醇。
8. DNA溶解:加入适量的蒸馏水,轻轻摇动试管,使DNA溶解。
结果与讨论:经过上述步骤,我们成功地提取到了细菌的DNA。
下面将对实验结果进行讨论。
1. DNA的外观:提取得到的DNA呈现为无色透明的溶液状,可以通过肉眼观察到。
2. DNA的浓度:可以通过分光光度计等仪器测量DNA的浓度,以确定提取的DNA量是否足够。
3. DNA的纯度:通过比色法或凝胶电泳等方法,可以评估DNA的纯度,即DNA中是否含有杂质。
4. DNA的稳定性:提取得到的DNA可以在低温下长期保存,以便后续的实验研究。
细菌DNA的提取是研究细菌遗传特性和进化过程的基础。
通过提取DNA,可以进行PCR扩增、测序、基因克隆等实验,进一步了解细菌的基因组结构和功能。
细菌基因组DNA提取方法
细菌基因组DNA提取方法1、取1.5mL菌液于2mL 离心管,12000rpm离心5min,弃上清;2、加入600ul 1xTE 重悬菌体沉淀,4℃ 12000rpm离心5min,弃上清;3、加入450ul 1xTE和50ul 10mg/mL 溶菌酶和10ul 100mg/mL 蜗牛酶,吹吸混匀,37℃孵育1h(或4℃过夜),每隔15min颠倒混匀一次;4、加入600ul TENS裂解液,和与沉淀等体积的玻璃珠,吹吸混匀,涡旋震荡10min 后,再加入30ul 20mg/mL 蛋白酶K,吹吸混匀,55℃孵育1h,每隔15min颠倒混匀一次;5、4℃ 12000rpm离心10min,转移上清至另一个干净的1.5mL 离心管;6、加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分混匀,-20℃静置2min,4℃ 12000rpm 离心5min;7、转移上清至另一个干净的 1.5mL 离心管,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),充分混匀,-20℃静置2min,4℃ 12000rpm离心5min;8、转移上清至另一个干净的1.5mL 离心管,加入1/10 体积的3M 醋酸钠,2倍体积(加入醋酸钠后的终体积)预冷的无水乙醇,充分混匀,-20℃沉淀2h。
(或加入0.6-0.8倍体积的异丙醇,-20℃沉淀2h),4℃ 12000rpm离心10min,弃上清;注:如需得到纯度更高的样品,可先用异丙醇沉淀,无菌水充分溶解后,离心取上清,再用醋酸钠+无水乙醇沉淀一次。
9、加入600ul 预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀,颠倒混匀,4℃ 12000rpm离心5min,弃上清;重复洗涤一次。
10、吸干离心管中的残留液体,待离心管风干后,加入30ul 无菌水和0.5ul 10mg/mL 的RNase A,吹吸混匀,取3ul电泳检测,剩余置于-20℃保存。
附:一、所需仪器恒温水浴锅、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、超净工作台、通风橱、电子天平、称量纸、药匙、各种规格移液器及吸头、剪刀、1.5mL离心管、2mL离心管、15mL离心管、50mL离心管、涡旋震荡仪、掌上离心机、4℃及-20℃冰箱、微波炉、电泳仪、凝胶成像仪、Nanodrop微量分光光度计、烧杯、三角瓶、量筒、玻璃棒、封口膜、橡皮筋。
细菌基因组DNA提取实验
细菌基因组DNA提取实验标签:细菌基因组DNA 提取细菌基因组DNA提取可以:(1)获得细菌基因组DNA;(2)作为PCR模板;(3)用于测序、遗传信息分析等。
实验方法细菌基因组DNA试剂盒提取法实验方法原理本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术,结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DNA 的目的。
适合于从1.0×109细菌中获得多至20 μg 的基因组DNA。
用于PCR、Southern 印迹分析、RAPD、RFLD 等分子生物学实验。
实验材料细菌培养物试剂、试剂盒细菌基因组DNA试剂盒仪器、耗材DNA 制备管小量滤器离心管实验步骤一、试剂盒组成、贮存、稳定性1. 说明书,耗材:DNA 制备管,小量滤器,2 ml 离心管,1.5 ml 离心管。
2. RNase A:50 mg/ml,室温保存。
3. 溶菌酶:50%甘油溶解溶菌酶,使溶菌酶浓度为50 mg/ml,-20℃密闭贮存。
4. Buffer S:细菌原生质制备液,加入RNase A 后,4℃密闭贮存。
5. 0.25M EDTA:室温密闭贮存。
6. Buffer G-A:裂解液,室温密闭贮存。
7. Buffer G-B:蛋白去除液,室温密闭贮存。
8. Buffer DV-A:Buffer DV 的制备液,请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制,室温密闭贮存。
9. Buffer DV:相分离液,室温密闭贮存。
10. Buffer BV:DNA 结合液,室温密闭贮存。
11. Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
12. Buffer W2 concentrate:去盐液。
使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀,室温密闭贮存。
可用100%乙醇或95%乙醇。
13. Eluent :2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
二、实验准备1. 第一次使用时,在Buffer W2 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。
细菌DNA提取方法
细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案:革兰氏阴性菌,如E.coli,一般有三种可以选择的方法。
一、水煮模板法——主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养18-24小时。
2、刮取1~2接种环菌苔加入150微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟。
3、12000转/分钟离心10分钟,取上清,-20摄氏度保存备用。
操作最简便,对试剂条件要求低。
缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质。
但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。
有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。
编者建议:此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次。
二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。
5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。
10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。
CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA 加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染。
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌是一种常见的细菌,其基因组DNA的提取非常重要,可以用于进一步的分子生物学研究。
本文将介绍如何提取大肠杆菌基因组DNA以及如何设计荧光定量PCR试验。
一、大肠杆菌基因组DNA的提取基因组DNA的提取是分子生物学实验的基础步骤之一、下面是一种常规的大肠杆菌基因组DNA的提取方法:1. 培养大肠杆菌:从冻存的大肠杆菌液体培养物中取出1 mL,加入含有适量抗生素(如氨苄青霉素或巴龙霉素)的LB培养基中。
以250 rpm的速度在37℃下培养12-16小时,直到菌体适量生长。
2.收集菌体:离心培养物,将上清液去除,保留细胞沉淀。
3.溶菌:使用适当的溶解液(如0.2MNaOH/1%SDS溶液),彻底悬浮菌体,并在65℃下孵育5分钟。
4.中和反应:向菌液中加入3M的钾酸溶液,通过中和作用将菌体中的DNA中和沉淀出来。
6.洗涤:用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
去除乙醇,使菌体中的盐等杂质完全去除。
7. 溶解:用 TE溶液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)或纯水溶解DNA沉淀。
如果需要更高浓度的DNA,可使用低TE溶液(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)。
荧光定量PCR(qPCR)是一种通过实时监测PCR反应的荧光强度来定量分析PCR产物的技术。
下面是一种针对大肠杆菌基因组DNA的定量PCR试验设计:试验目的:测定大肠杆菌基因组DNA中一些特定基因的拷贝数。
试验步骤:1.制备PCR反应体系:根据需要测定的基因和引物的特异性设计引物。
将PCR反应体系组分按照以下配方进行调配:- 模板DNA:5 ng-引物(正向和反向):0.2μM-qPCR反应缓冲液:根据厂家推荐的浓度加入适量-dNTP混合液:0.2mM-热启动酶:根据厂家推荐的浓度加入适量- ddH2O:适量2.设计合适的PCR程序:-预热:95℃,5分钟-循环:95℃,30秒;55℃,30秒;72℃,30秒(重复30-40个循环)-最终延伸步骤:72℃,10分钟-保存在4℃下待用3.实施定量PCR试验:-根据样本中DNA浓度的不同,选择适当的试管和引物。
细菌DNA提取的方法
快速提取细菌和酵母菌DNA的方法材料:菌株-革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌;苯酚、氯仿(三氯甲烷);STE缓冲液(100mM NaCl,10mM Tris/HCl,1mM EDTA,pH 8.0)TE缓冲液(10 mMTris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).RNase: 10mg/mL方法步骤:(1)吸取1mL细菌悬浮液8000rpm 2min (除肺炎双球菌外,13000rpm 10min);(2)倒去上清液,并用400uL的STE缓冲液洗涤两次;(3)8000rpm离心2min (除肺炎双球菌外,13000g 10min);(4)倒去上清液,并加入200uL的TE缓冲液是沉淀再次悬浮;(5)吸取100uL的饱和Tris-苯酚于离心管中,涡旋振荡混合60s(酵母菌120-200s)使细胞溶解;(6)接着在4℃的条件下13000rpm 5min离心时水相和有机相分层;(7)从水相中吸取160uL转移至新的1.5mL离心管,并加入40uL的TE缓冲液至200uL;添加100uL氯仿(三氯甲烷)在4℃条件下13000g 离心5min,目的是利用氯仿将溶解产物进行纯化至白色的界面不在出现;重复2-3次;(8)吸取上清液160uL于洁净的1.5mL离心管中,添加40uL TE缓冲液和5uLRNase 37℃培养10min 以消解RNA;(9)然后添加100uL的氯仿混匀,4℃条件下13000rpm 5min;(10)吸取150uL上清液于新的1.5mL离心管中,此时上清液中含有纯化的DNA可直接用于实验或-20℃保存。
该方法的优点:(1)该方法省略了用SDS、溶菌酶和蛋白酶K溶解细菌的步骤,取而代之的是利用苯酚。
(2)省略了4-6次离心;(3)省略了水浴、沉淀、洗脱、和烘干等步骤。
细菌DNA提取方法
细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案:革兰氏阴性菌,如,一般有三种可以选择的方法。
一、水煮模板法——主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养18-24小时。
2、刮取1~2接种环菌苔加入150微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟。
3、12000转/分钟离心10分钟,取上清,-20摄氏度保存备用。
操作最简便,对试剂条件要求低。
缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、等杂质。
但是作为一般目的的PCR 反应模板已经足够了。
有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。
编者建议:此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次。
二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。
5、取菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
9、加入倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。
10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。
CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA 加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染。
细菌总DNA提取方法
细菌总DNA提取方法100412 溶液制备:母液:1)1.0M Tris-HCl, 称取60.57g Tris(Tris Amino),溶于500ml ddH2O中,用HCl调整pH8.0;2)0.5M EDTA,称取37.32g EDTA-Na,溶于100ml ddH2O中,用NaOH调整pH8.0。
STE buffer(pH8.0):100mM NaCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0;高压灭菌,4℃保存。
TE buffer(pH8.0):10mmol/L Tris-HCl (pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0)。
取5ml 1mol/L Tris-HCl母液,1ml 0.5mol/L EDTA母液,置于400ml的ddH2O中,然后定容到500ml,高压灭菌后,4℃保存备用;实验步骤:1、取1ml 液体培养的菌体(Gram-negative or Gram-positive bacteria),离心8000 rmp 2min;(肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp 10min,以沉淀细胞)2、弃上清,用400ul STE buffer 清洗两次,每次离心8000 rmp 2min(肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp 10min,以沉淀细胞)3、弃上清,加入200ul TE buffer悬浮沉淀;4、加入100ul Tris饱和酚(Tris-saturated phenol,pH8.0); 振荡器振荡60-120S,以裂解细胞;注:M. MB200振荡120S, E.coli振荡60S.5、4℃,离心13000rmp 5min,以将水相(aqueous phase)从有机相(orangic phase)中分离出来;6、取160ul上层水相,转移至另一个1.5ml Ep管中;7、加入40ul TE buffer,以达到200ul体积,再与100ul 氯仿(chloroform)混合,可用1ml 移液抢吹打;8、4℃,离心13000rmp 5min;9、用氯仿抽提裂解液,直到白色的界面(white interface)消失,重复2-3次;10、将160ul上层水相移入一干净的1.5ml的Ep管中;11、加入40ulTE buffer,5ul RNase(10mg/ml),37℃保温10min;12、加入100ul氯仿,混匀,4℃,离心13000rmp 5min;13、将150ul上清水相移入另一个1.5mlEp管中,-20℃保存。
细菌DNA的提取,不用试剂盒的方法
DNA的提取:
(1)从平板上挑一个单菌落至3 ml含相应抗生素的TY液体中28︒C培养至稳定期;
(2)取1 ml菌液14,000 rpm离心2 min,用1 ml无菌水重悬菌体并洗涤两次,再次14,000 rpm离心菌体2 min,用270 μl TE重悬菌体(RNAse);
(3)加入10 mg/ml的溶菌酶 15 μl,0︒C水浴30 min,再依次加入15 μl 10%的SDS和10 μl 100 mg/ml的蛋白酶K并混匀,65︒C水浴30 min;
(4)加入200 μl 5 M NaCl(4︒C)剧烈振荡,加入500 μl 25: 24: 1的酚:氯仿:异戊醇后涡旋振荡混匀,10,000 rpm离心10 min,取上清液至1.5 ml离心管中,重复抽提直至在分界面看不到明显的白色絮状物(至少3次);
(5)将上清液转移至1.5 ml离心管,用500 μl氯仿再抽提一次,取上清液,加入500 μl异丙醇沉淀(应该立即能看到白色絮状物),冰浴10 min,14,000 rpm离心10 min,用预冷的70%乙醇洗三次,自然吹干,用50 μl TE 溶解;
(6)将抽提产物取5 μl直接进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
试剂的配制:
10×TE缓冲液(pH 8.0):100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA
配制:1000ml
1 mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0) 100ml
500 mmol/L EDTA (pH8.0) 20 ml
苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1):将量取25 ml Tris-HCl(pH8.0)平衡苯酚,加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇,充分混合后,移入棕色玻璃瓶中,4℃保存。
细菌基因组DNA的提取
植物材料--液氮研磨
动物组织--匀浆或液氮研磨
组培细胞--蛋白酶K
细菌--溶菌酶破壁
酵母--破壁酶或玻璃珠 高温温浴时,定时轻柔振荡
四、注意事项——细胞裂解
采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔
02
离心分离两相时,应保证一定的转速和时间
03
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时,应提供相应的缓冲体系
问题三:DNA提取量少
对 策
原因
五、DNA提取常见问题
简要叙述酚氯仿抽提DNA体系后出现的现象及其成因。
沉淀DNA时为什么要用无水乙醇?
基因工程教学网站:
六、问题与讨论
材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融
如:苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
RNase
DNase
溶菌酶
蛋白酶K
核酸制备中常用的酶
破碎细胞(防止核酸酶的作用)
01
微生物:溶菌酶、SDS裂解。
02
高等植物:捣碎器破碎、液氮研磨。
03
酶法:蛋白酶,如胰蛋白酶,
04
冰冻法:反复冻融或液氮冻后组织捣碎。
05
动物:液氮处理后用匀浆器破碎。
06
细胞器DNA:首先纯化细胞器。
DNA提取常见问题 对 策
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子
细菌dna提取方法及原理
细菌dna提取方法及原理嘿,咱今天就来讲讲细菌 DNA 提取这档子事儿哈!你知道不,细菌那小小的身体里可藏着大大的秘密呢,而要把这些秘密给揪出来,就得靠提取它们的 DNA 啦!提取细菌 DNA 呢,就好像是一场和小细菌的“战斗”。
首先,咱得把细菌给“逮住”,让它们乖乖地待在那儿。
这就好比要抓住一群调皮的小孩子,得有合适的办法才行。
然后呢,就是要打破它们的“保护壳”,也就是细胞壁啦。
这细胞壁就像是小细菌的“盔甲”,得想办法给它弄开。
那怎么弄开呢?这就有不同的办法咯!就像你开门有钥匙,撬门有工具一样。
可以用一些化学试剂呀,就像给细菌来个“温柔的攻击”,让细胞壁慢慢变软、破裂。
或者用物理的方法,比如给它们来点小小的“震动”,让细胞壁扛不住就破啦。
等细胞壁破了,DNA 就露出来啦。
这时候,就像找到了宝藏一样兴奋呢!但是别急,这还只是开始。
接下来,要把 DNA 从其他乱七八糟的东西里分离出来。
这就好像在一堆沙子里找金子,得仔细点、耐心点。
提取细菌 DNA 的原理呢,其实也不难理解。
就好比你要从一堆杂物里找出你最喜欢的那个玩具,得知道那个玩具的特点呀。
DNA 也有它自己的特点,咱就是根据这些特点来把它给找出来的。
想象一下,细菌就像一个小小的“宝藏盒子”,而 DNA 就是盒子里最珍贵的宝贝。
咱要做的就是打开盒子,把宝贝拿出来,还不能弄坏了其他东西。
这可不是一件容易的事儿呀,但科学家们就是有办法做到!在这个过程中,每一步都得小心谨慎。
就像走钢丝一样,稍有不慎可能就前功尽弃啦。
而且不同的细菌可能还需要不同的方法,就像不同的锁得用不同的钥匙开一样。
提取出来的 DNA 用处可大啦!可以用来研究细菌的特性呀,看看它们为什么会这样、那样。
还可以用来诊断疾病呢,就像医生通过检查找到病因一样。
总之呢,细菌 DNA 提取这事儿啊,看似简单,实则暗藏玄机。
得有耐心、有技巧,还得有点小智慧。
就像一场有趣的冒险,等你真正掌握了,就会发现其中的乐趣和神奇啦!怎么样,是不是对细菌 DNA 提取有了更深的了解呀?哈哈!。
细菌DNA提取具体流程和原理
5、取上清于另一EP,加等体积的酚:氯仿:异戊醇,混匀,12000*5。
6、取上清于另一EP,加等体积的酚:氯仿:异戊醇,混匀,12000*5。
7、加入等体积异丙醇(沉淀DNA),温和混匀,-20℃,1h。
8、12000*3,弃上清,得沉淀,加入1ml70%乙醇,12000*2,自然干试剂
作用
KAC和乙醇
沉淀DNA,中和碱
Tris-HCl+EDTA(TE)
抑制DNA酶活性
SDS
破膜,结合蛋白质
酚:氯仿:异戊醇
去蛋白质
醋酸安
沉淀蛋白质,中和NaOH
异戊醇
减少泡沫,易于分相
1、取5ml菌液,离心去上清,加入50μL ddH2O悬浮,沸水浴煮20min,速度液氮冷冻,反复2次。
2、65℃预热细胞提取液(100mmol/L的Tris-HCl,ph8.0;5mmol/L的EDTA,500mmol/L的NaCl;1.25%SDS;1%β-硫基乙醇)。
3、加入500μL细胞提取液,颠倒,65℃,时间为0.5h,每10min颠倒一次。
煮沸法提取细菌dna步骤
煮沸法提取细菌dna步骤
煮沸法提取细菌DNA是一种简单有效的DNA提取方法。
要想成功
地进行DNA提取,需要按照以下步骤进行操作:
1. 收集细菌样品。
选择合适的细菌样品并将其培养至对数生长期。
浓缩细菌菌液可获得更高DNA产量。
2. 细胞破碎。
将细菌菌液转移到离心管中,将其离心收集细胞沉淀。
将细胞沉淀加入含有蛋白酶K和SDS的溶液中(如TE缓冲液或海
盐缓冲液),并在60℃条件下煮沸10-15分钟。
3. 去除蛋白质和RNA。
使用苯酚/氯仿混合物或离心柱/载体提取
蛋白质和RNA,留下DNA。
4. 沉淀DNA。
使用无水乙醇沉淀DNA,定量并保存。
5. 纯化DNA。
使用柱过滤、琼脂糖凝胶电泳或商用基因分离试剂
盒等方法纯化DNA,获得更高纯度的DNA。
总的来说,煮沸法提取细菌DNA是一种快速、简单、成本低、适
用于小样品的DNA提取方法。
在进行实验时,需注意样品处理、破碎、离心、沉淀和纯化过程中的每一个细节,才能成功提取到高纯度的DNA 样品。
细菌基因组dna提取原理
细菌基因组dna提取原理
细菌基因组DNA提取是通过一系列化学和物理方法将细菌细
胞中的DNA分离出来的过程。
以下是细菌基因组DNA提取
的原理:
1. 细胞破碎:首先,细菌细胞需要被破碎以释放DNA。
这可
以通过物理方法(如超声波处理或振荡器震荡)或化学方法(如细菌细胞壁消化酶的作用)来实现。
2. DNA溶解:破碎的细胞中,DNA需要被从其他细胞组分
(如蛋白质、RNA等)中分离出来。
加入适当的缓冲液可以
帮助DNA在水中溶解,并防止其被降解。
3. 蛋白质去除:细胞溶液中的蛋白质可通过加入蛋白酶K等
蛋白酶来消化。
蛋白酶可以将蛋白质分解为小片段,使其易于去除。
4. RNA去除:通过加入DNase酶,可将RNA降解为核苷酸
单元,并与其配体结合。
随后,加入酸性酚和氯仿,RNA可
在其中分配到的有机相中离心沉淀,从而与DNA分开。
5. DNA沉淀:通过加入醇(如乙醇或异丙醇)和盐(如乙酸
钠或氯化钠),DNA可以沉淀出来。
醇可以使DNA不溶于溶液中,盐可以中和溶液中的带电颗粒,如离子。
6. 洗涤:沉淀的DNA需要被洗涤以去除残留的盐和其他杂质。
这可以通过使用酒精洗涤和离心步骤来实现。
7. 重溶:最后,沉淀的DNA会在某种缓冲液中重溶,以便进行后续的实验操作,如PCR扩增、测序等。
通过以上步骤,我们可以从细菌中高纯度地提取出基因组DNA,为后续分子生物学研究提供基础。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
细菌DNA提取方案细菌DNA提取方案:革兰氏阴性菌,如E.coli,一般有三种可以选择的方法。
一、水煮模板法——主要用于PCR反应1、接种单菌落于LB或脑心平板,连续画线,37摄氏度培养18-24小时。
2、刮取1~2接种环菌苔加入150微升三蒸水中,混匀,100摄氏度煮沸10分钟。
3、12000转/分钟离心10分钟,取上清,-20摄氏度保存备用。
操作最简便,对试剂条件要求低。
缺点是纯度不够高,可能会含有RNA、蛋白等杂质。
但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。
有人称扩增4kb以下片段都可用此种方法制取模版,编者用此类模板PCR可以扩增到3500bp的片段。
编者建议:此法得到的模版保存时间短,强烈建议每月重新制作一次。
二、CTAB/NaCl 法1、接种一单菌落于5mlLB中,30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀,-20℃保存备用。
5、取3.5ml菌悬液,加入184μl10%SDS,混匀,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
9、加入0.6倍的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。
10、用1mlTE溶解DNA,加入终浓度为20μg/mlRNaseA,4℃保存。
CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高,蛋白杂质较少,保存时间长,编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA 加在第5步温育的时候,这样最后没有RnaseA污染。
每一步操作细致一些,得到的DNA可用于Southern blot。
编者建议:长时间保存DNA可放于-20℃,但要尽量减少反复冻融,否则影响DNA质量。
三、盐析法1、1.5ml对数期菌液2、12000rpm 30 s3、200ul裂解液(同CTAB/NaCl法),37c,1hr4、66ul 5M NaCL,混匀充分,12000rpm 10min5、上清用粗枪头取至新管6、等体积酚充分混匀,12000rpm 3min,反复抽提至无蛋白层7、取水层,等体积氯仿混匀,12000rpm 3min8、上清至新管,2倍体积预冷无水乙醇9、-20C,20min,14000rpm,15min10、400ul 70%冷乙醇洗涤11、干燥,100ul 20ug/ml RNaseA,37C,30min12、2倍体积无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗涤13、干燥,溶于100ul TE介于方法一和方法二之间,CTAB虽然取出糖分效果较好,但CTAB本身也是有毒的,所以此方法放弃了CTAB。
革兰氏阳性菌,由于细胞壁的结构与阴性菌有差别,裂解比阴性菌稍微麻烦一些,可以采取CTAB/NaCl法稍加修改,在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶,37度温育1h。
实验注意:提基因组最好要将枪头尖剪掉(剪掉以后在酒精灯上迅速过一下,使其断口圆滑)。
以免枪头损伤基因组!抽干时最好是风干!细菌基因组DNA的提取方法综述,提供了5种方法。
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中,12000rpm离心1min, 丢去上清夜,收集菌体。
B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸,20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8)混匀,置于37oC水浴1hr。
C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液,混匀后于13000rpm离心15min。
D.取上清液,用苯酚抽提2次,氯仿抽提1次。
E.加两倍体积无水乙醇,1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0),-20度保存1小时后,13000rpm离心15min,弃上清液,沉淀用70%乙醇洗2次;置于室温干燥后,溶于50ulTE溶液中,置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.,第二天4000rpm离心10min收集菌体,用Washing TE (50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0)洗菌体2次,之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中,先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS,轻轻混匀后50℃放置3h~5h,接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次,苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次,氯仿抽提一次后,乙醇沉淀DNA,用自动移液器吸管头将絮状DNA 沉淀块吸附到Ep管中,70%乙醇洗2次,干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
31) 细菌培养:细菌接种于5ml液体培养基中,37℃摇床(300rpm)培养过液。
2) 细菌收集:取1ml培养物于1.5ml EP管中,室温8000rpm离心5min,弃上清,沉淀重新悬浮于1ml TE(pH8.0)中(用ddH2O也行)。
3) 菌体裂解:加入6μl 50mg/ml的溶菌酶,37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl,10%SDS 110μl,20mg/ml的蛋白酶K 3μl,50℃作用3h或37℃过夜。
(此时菌液应为透明粘稠液体)4) 抽提:菌液均分到两个1.5ml EP管,加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,室温放置5-10min。
12000rpm离心10min。
抽提两次。
(上清很粘稠,吸取时应小心,最好枪头尖应剪去)5) 沉淀:加0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。
1 2000rpm 离心10min。
6)洗涤:沉淀用75%的乙醇洗涤。
7) 抽(凉)干后,溶于50μl ddH2O中,取2-5μl电泳。
作PCR 模板用。
4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium.2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA.3) Freeze cell suspension at -20C4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min.6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C.8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting).10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA.11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.51) 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2) 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。
3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5) 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6) 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7) 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,沉淀DNA。
8) 用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。
如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。
注:1)CTAB/NaCl溶液:4.1g NaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2)氯仿:异戊醇(24:1),酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),异丙醇,70% 乙醇,TE,10% SDS,蛋白酶K (20mg/ml或粉剂),5mol/L NaCl。
本方法通过SDS裂解细胞,蛋白酶降解蛋白,CTAB去除多糖成分一:仪器:同方法一二:试剂:TE、TAE 缓冲液;10%SDS;5MNaCL;20mg/ml蛋白酶K;CTAB/NaCL溶液(10% CTAB,0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml水中,缓慢加入10gCTAB,加热溶解);25/24/1,酚/氯仿/异戊醇; 24/1,氯仿/异戊醇;异丙醇;70%及100%乙醇三:操作 1.5ml 对数生长期细菌细胞离心,5000rpm,1min 沉淀溶于500μl TE缓冲液中混匀30μl 10%SDS,3μL蛋白酶K,混匀,37℃,1小时100μl NaCL(5M) 混匀80μl的CTAB/NaCL,*混匀;65℃10min(可不做)加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,离心12000rpm,4-5min 取上清,以下操作与方法一中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。