荧光 基础知识
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• 浓度：荧光与溶液浓度只在很稀的情况下才成立。溶液太浓，由于激发光束 和发射光束都产生吸收，造成非线性。 • 氧分子的荧光淬灭。如果溶剂没有除气时。 • 光解作用。激发光束与样品溶液发射光解（褪色）反应。 • 样品混合物的光谱重叠，激发、发射的谱带重叠。调节狭缝宽度。 • 污染：玻璃容器，移液管等。 • 较小的环境效应：重原子效应，杂质淬灭，粘度。
Concentration 荧光定 量分析
荧光测量的优点
灵敏度高 • • • 比UV-Vis方法灵敏 100 - 1000 倍 UV-Vis方法测量的是一定波长的光透过样品后的衰减，是高背景上的相对值 荧光是样品被激发后发出的光，测量的是低背景上的绝对发光
选择性好
• • 能吸收光辐射的分子不一定都能发出荧光共轭键，刚性平面结构，给电子取代基 能发出荧光的分子结构或介质环境不同，荧光光谱也不相同吸收（激发）和发射 光谱
激发和发射波长固定不动，测量荧光强度随时间的变化 情况
• 动力学测量（Kinetics） – 化学反应常改变荧光强度 – 时间刻度可为sminhr • 磷光寿命测量Lifetimes (phosphorescence) – change in intensity usually due to uni-molecular processes – 时间刻度为mss
激发波长固定，对发射 波长进行扫描
1、形状与激发 波长无关 2、和吸收光谱 成镜像关系
荧光强度v发射波长
Int
Detector
Emission scan射光谱的强度
同步扫描光谱
激发和发射波长都做扫描
Source Monochro mator excitation Sample
荧光定量基础
F ( I 0 I ) (1 e
kcl
) I 0 kcL
ф：荧光效率，一般与波长无关 I0：入射光强度，（I0-I）为样品吸收的光通量 K：样品吸收系数 C：样品浓度 L：吸收光程 – 荧光灵敏度比UV好，因为：荧光与入射光强度 成正比，可以用很强的Xe灯作光源。检测弱光
Reads 荧光值读数
Simple Reads：简单读数
Advance Reads：高级读数
直接读取某一对或几对激发波长/ 发射波长处的荧光强度值
Thermal Application 解链温度Tm 荧光强度随温度的变化曲线，常用于研 究不同生物体DNA的解链温度Tm
Ratio 细胞内的离子浓度研究
时可以用光电倍增管。 – c浓度适宜的情况下，荧光和溶液浓度成正比。
荧光强度的概念
– 相对值 – 没有单位 – 仪器不同，强度也不同
» 所以，荧光测量需用工作曲线来校正（相对分析）。 » 线性范围很窄，减小误差的最好办法是稀释到线性范围。
影响荧光强度的因素
影响荧光强度的因素：
– – – – pH 溶剂 温度 其它因素：
时间刻度 • 磷光 (ms － sec) – 1 ms 数据步进值 – 在大多情况下可实时 采集 • 荧光 (ns) – 高端荧光，not Cary Eclipse
动力学和寿命测量比较
动力学：一次照射激发，一次采集
Intensity
Intensity
3祍 pulse w idth D elay tim e
I=Ioexp(-lc) weak fluorescence signal
concentrated solution
I=Ioexp(-lc)
stronger relative fluorescence signal detected
dilute solution
测量大浓度样品的情况
弯曲
L-format (普通应用)
降低入射光束散射干扰（瑞利散射，拉曼散射）的办法：
– 调整激发波长 – 发射光束加滤光片 – 减出空白
影响荧光定量的因素
– 样品处理带来的发光，如指纹 – 溶解的杂质带来的发光
• 玻璃容器 • 试剂杂质
– 细菌生长带来的发光 – 一般实验室污染造成的发光
高浓度下的“Inner Filter” Effect
• 依赖于波长分布 (发射光学系统，检测器类型)
所以需要光谱校正来解决仪器间的光谱比较! • 可以对激发、发射光谱进行比较 • 仅当需要进行不同仪器间的光谱比较时才需要校正 • 溶剂产生的发射值必需另外进行减除（作为基线校正来减除）
激发和发射光谱实际情况
理想情况
实际情况
Excitation Wavelength (nm)
激发波长：a到b扫描
发射波长：a＋d到b+d同时改变 波长，d为增量
emission Monochro mator Detector
荧光强度v激发波长
有利于分离复 杂的混合物， 如：原油
光谱校正
荧光不象吸收光谱一样是绝对测量 • 不遵循 Beer-Lambert 定律 • 荧光强度正比于 激发光源强度I0, 样品荧光效率ffl 和 样品吸收效率 Fabs 激发光源I0 在不同仪器间其值不一样 • 依赖于波长分布 ( 光源，激发光学系统) 荧光强度会不一样
荧光分光光度计 基础知识
1. Cary Elipse 硬件原理 2. 分子发光原理与测量 3. 软件 3.1 Scan 3.2 Concentration 3.3 kenitics， Lifetime 3.4 Simple Reads，Advanced Reads 3.5 Thermal 3.6 Ratio 3.7 Validate 3.8 System information，Align，ADLSHELL 4. 其它
Excitation Wavelength (nm)
Emission Wavelength (nm)
Emission Wavelength (nm)
如何校正
• Commands 菜单 • 校正因子存储在 EPROM
激发光谱校正（220..600nm) 1.仪器置发射波长于 640 nm 2. 提示插入浓的罗丹明溶液 RhB 3. 做220.. 600 nm的激发光谱扫描 4. 激发校正因子计算并存储在 Excorr.csv文 件 (c:/Varian/Cary Eclipse WinFLR/ Correction Curves/) 发射光谱校正（220..600nm) 1. 提示插入毛玻璃 Diffuser 2. 同步扫描 220 to 600 nm (Delta=0 nm) 3. 发射校正因子存储在文件Emcorr.csv (c:/Varian/Cary Eclipse WinFLR/ Correction Curves/) 发射光谱校正（>600nm) 1.需要 NIST 标定过的光源
Chemiluminescence Bioluminescence
Other examples Sonoluminescence Electroluminescence
• • • • • • • •
Photoluminescence光致发光 • Fluorescence 荧光 • Phosphorescence 磷光 Chemiluminescence 化学发光 Bioluminescence 生物体之发光 Electroluminescence 电致发光，场致发光 Radioluminescence 辐射发光 Triboluminescence 摩擦致发光 Sonoluminescence 声致发光 Catho doluminescence 阴极发光
S0
荧光，磷光光谱间的特点
吸 收 光 谱
荧 光 光 谱
磷 光 光 谱
•都为光致发光 •荧光：S1S0，波长比吸收波长长，寿命 10-9～10-6s •磷光：T1S0，更长的波长，寿命10-4s或更长至数分钟
仪器数据采集工作方式：荧光、生化发光
荧光（寿命10-11－ 10-7秒） • 需要光源激发 • 激发光源照射的情况下测量样品产生的发射光 生化发光 • 不需要光源激发 • 照射光源熄灭的情况下测量样品本身产生的发射光
front surface三角形比色皿 (用于浓溶液和膜)
定量小结
•荧光强度仅在很低浓度的情况下才和溶液浓度成正比 •必需确定仪器的线性范围 •典型情况 Cmax= 0.05/l ， 激发波长处的摩尔吸收系数， l为池长。
时间相关谱图测量
荧光强度随时 间的变化 荧光强度
时间
时间相关谱图测量
G ate tim e
A+BC A + Excitation A* A* A + Emission
3祍 pulse w idth D elay tim e
G ate tim e
T e (m im s)
Intensity
Intensity
T e (m im s)
H igh [A]
H igh [B]
•
混合物的分析测定（同步扫描）
光度分析之不足
Not a universal technique - not many molecules fluoresce 并非一种通用技术，不太多的分子能发荧光 Requires more expertise / understanding 需要更多的专门技术和知识 Relative technique 相对分析技术
细胞内的离子浓度研究： Na+, K+, Ca2+, H+, Mg2+ , Zn2+等
原理： 根据某些荧光染料与特定的游离离 子结合后会产生明显的激发波长或发射波 长的改变，因而可以据此分辨离子的结合 态或游离态。
例如：Fura-2染料，在未与钙离子结合前 其激发峰值在380nm，在与钙离子结合后， 其激发峰值改变到340nm。根据 340nm/380nm 的比值可以研究钙离子浓度的变化。
仪器数据采集工作方式：磷光
磷光 (寿命 10-3 － 102 秒)
• 需要光源激发 • 激发光源熄灭的情况下测量样品的发射光
Scan 扫描光谱
仪器有两套光栅分光系统，根据激发和发射光栅转动的 形式可形成三种光谱： 激发光谱：激发光栅转动 发射光谱：发射光栅转动
同步光谱：激发和发射光栅同步转动
激发光谱
T e (m im in)
Intensity
3祍 pulse w idth D elay tim e G ate tim e
寿命：单照射，连续采集数据
A + Excitation A* A* A + Emission
G ate tim e
Intensity
T e (m im s)
T e (m im s)
动力学应用（Kinetics application）
测量发射强度随时间的变化，包含： • 荧光Fluorescence • 磷光Phosphorescence • 生化发光Chemi/Bioluminescence 最后得到荧光强度对应时间的谱图，再 用零级、一级、二级公式拟合
寿命测量应用（Lifetimes application）
荧光、磷光产生
Triplet State 三重态 （两个非成对电子 ）
Singlet State 单重态 （成对电子）
S2 T2
3.Intersystem Crossing 体系间跨越
2. Internal Conversio 内部转换
T1
4. Phosphorescence 磷光
S1
1.吸收
3. Fluorescence 荧光
By VarianCD Zuomingfu
硬件原理
光源
单色器
激发
样品
单色器
发射
检测器
Cary Eclipse光路图
发射波长光栅 发射检测器 两套光学系统： 激发和发射
样品
激发波长光栅
光源 激发检测器
发光类型
Luminescence
Photoluminescence Fluorescence Phosphorescence
Light source Monochromator excitation emission Monochromator Sample
发射波长固定，对激发 波长进行扫描
Detector
荧光强度v激发波长
Int
Excitation scan
样品的激发光谱和吸 收光谱相同
发射光谱/荧光光谱
Light source Monochromator excitation emission Monochromator Sample
Concentration 荧光定 量分析
荧光测量的优点
灵敏度高 • • • 比UV-Vis方法灵敏 100 - 1000 倍 UV-Vis方法测量的是一定波长的光透过样品后的衰减，是高背景上的相对值 荧光是样品被激发后发出的光，测量的是低背景上的绝对发光
选择性好
• • 能吸收光辐射的分子不一定都能发出荧光共轭键，刚性平面结构，给电子取代基 能发出荧光的分子结构或介质环境不同，荧光光谱也不相同吸收（激发）和发射 光谱
激发和发射波长固定不动，测量荧光强度随时间的变化 情况
• 动力学测量（Kinetics） – 化学反应常改变荧光强度 – 时间刻度可为sminhr • 磷光寿命测量Lifetimes (phosphorescence) – change in intensity usually due to uni-molecular processes – 时间刻度为mss
激发波长固定，对发射 波长进行扫描
1、形状与激发 波长无关 2、和吸收光谱 成镜像关系
荧光强度v发射波长
Int
Detector
Emission scan射光谱的强度
同步扫描光谱
激发和发射波长都做扫描
Source Monochro mator excitation Sample
荧光定量基础
F ( I 0 I ) (1 e
kcl
) I 0 kcL
ф：荧光效率，一般与波长无关 I0：入射光强度，（I0-I）为样品吸收的光通量 K：样品吸收系数 C：样品浓度 L：吸收光程 – 荧光灵敏度比UV好，因为：荧光与入射光强度 成正比，可以用很强的Xe灯作光源。检测弱光
Reads 荧光值读数
Simple Reads：简单读数
Advance Reads：高级读数
直接读取某一对或几对激发波长/ 发射波长处的荧光强度值
Thermal Application 解链温度Tm 荧光强度随温度的变化曲线，常用于研 究不同生物体DNA的解链温度Tm
Ratio 细胞内的离子浓度研究
时可以用光电倍增管。 – c浓度适宜的情况下，荧光和溶液浓度成正比。
荧光强度的概念
– 相对值 – 没有单位 – 仪器不同，强度也不同
» 所以，荧光测量需用工作曲线来校正（相对分析）。 » 线性范围很窄，减小误差的最好办法是稀释到线性范围。
影响荧光强度的因素
影响荧光强度的因素：
– – – – pH 溶剂 温度 其它因素：
时间刻度 • 磷光 (ms － sec) – 1 ms 数据步进值 – 在大多情况下可实时 采集 • 荧光 (ns) – 高端荧光，not Cary Eclipse
动力学和寿命测量比较
动力学：一次照射激发，一次采集
Intensity
Intensity
3祍 pulse w idth D elay tim e
I=Ioexp(-lc) weak fluorescence signal
concentrated solution
I=Ioexp(-lc)
stronger relative fluorescence signal detected
dilute solution
测量大浓度样品的情况
弯曲
L-format (普通应用)
降低入射光束散射干扰（瑞利散射，拉曼散射）的办法：
– 调整激发波长 – 发射光束加滤光片 – 减出空白
影响荧光定量的因素
– 样品处理带来的发光，如指纹 – 溶解的杂质带来的发光
• 玻璃容器 • 试剂杂质
– 细菌生长带来的发光 – 一般实验室污染造成的发光
高浓度下的“Inner Filter” Effect
• 依赖于波长分布 (发射光学系统，检测器类型)
所以需要光谱校正来解决仪器间的光谱比较! • 可以对激发、发射光谱进行比较 • 仅当需要进行不同仪器间的光谱比较时才需要校正 • 溶剂产生的发射值必需另外进行减除（作为基线校正来减除）
激发和发射光谱实际情况
理想情况
实际情况
Excitation Wavelength (nm)
激发波长：a到b扫描
发射波长：a＋d到b+d同时改变 波长，d为增量
emission Monochro mator Detector
荧光强度v激发波长
有利于分离复 杂的混合物， 如：原油
光谱校正
荧光不象吸收光谱一样是绝对测量 • 不遵循 Beer-Lambert 定律 • 荧光强度正比于 激发光源强度I0, 样品荧光效率ffl 和 样品吸收效率 Fabs 激发光源I0 在不同仪器间其值不一样 • 依赖于波长分布 ( 光源，激发光学系统) 荧光强度会不一样
荧光分光光度计 基础知识
1. Cary Elipse 硬件原理 2. 分子发光原理与测量 3. 软件 3.1 Scan 3.2 Concentration 3.3 kenitics， Lifetime 3.4 Simple Reads，Advanced Reads 3.5 Thermal 3.6 Ratio 3.7 Validate 3.8 System information，Align，ADLSHELL 4. 其它
Excitation Wavelength (nm)
Emission Wavelength (nm)
Emission Wavelength (nm)
如何校正
• Commands 菜单 • 校正因子存储在 EPROM
激发光谱校正（220..600nm) 1.仪器置发射波长于 640 nm 2. 提示插入浓的罗丹明溶液 RhB 3. 做220.. 600 nm的激发光谱扫描 4. 激发校正因子计算并存储在 Excorr.csv文 件 (c:/Varian/Cary Eclipse WinFLR/ Correction Curves/) 发射光谱校正（220..600nm) 1. 提示插入毛玻璃 Diffuser 2. 同步扫描 220 to 600 nm (Delta=0 nm) 3. 发射校正因子存储在文件Emcorr.csv (c:/Varian/Cary Eclipse WinFLR/ Correction Curves/) 发射光谱校正（>600nm) 1.需要 NIST 标定过的光源
Chemiluminescence Bioluminescence
Other examples Sonoluminescence Electroluminescence
• • • • • • • •
Photoluminescence光致发光 • Fluorescence 荧光 • Phosphorescence 磷光 Chemiluminescence 化学发光 Bioluminescence 生物体之发光 Electroluminescence 电致发光，场致发光 Radioluminescence 辐射发光 Triboluminescence 摩擦致发光 Sonoluminescence 声致发光 Catho doluminescence 阴极发光
S0
荧光，磷光光谱间的特点
吸 收 光 谱
荧 光 光 谱
磷 光 光 谱
•都为光致发光 •荧光：S1S0，波长比吸收波长长，寿命 10-9～10-6s •磷光：T1S0，更长的波长，寿命10-4s或更长至数分钟
仪器数据采集工作方式：荧光、生化发光
荧光（寿命10-11－ 10-7秒） • 需要光源激发 • 激发光源照射的情况下测量样品产生的发射光 生化发光 • 不需要光源激发 • 照射光源熄灭的情况下测量样品本身产生的发射光
front surface三角形比色皿 (用于浓溶液和膜)
定量小结
•荧光强度仅在很低浓度的情况下才和溶液浓度成正比 •必需确定仪器的线性范围 •典型情况 Cmax= 0.05/l ， 激发波长处的摩尔吸收系数， l为池长。
时间相关谱图测量
荧光强度随时 间的变化 荧光强度
时间
时间相关谱图测量
G ate tim e
A+BC A + Excitation A* A* A + Emission
3祍 pulse w idth D elay tim e
G ate tim e
T e (m im s)
Intensity
Intensity
T e (m im s)
H igh [A]
H igh [B]
•
混合物的分析测定（同步扫描）
光度分析之不足
Not a universal technique - not many molecules fluoresce 并非一种通用技术，不太多的分子能发荧光 Requires more expertise / understanding 需要更多的专门技术和知识 Relative technique 相对分析技术
细胞内的离子浓度研究： Na+, K+, Ca2+, H+, Mg2+ , Zn2+等
原理： 根据某些荧光染料与特定的游离离 子结合后会产生明显的激发波长或发射波 长的改变，因而可以据此分辨离子的结合 态或游离态。
例如：Fura-2染料，在未与钙离子结合前 其激发峰值在380nm，在与钙离子结合后， 其激发峰值改变到340nm。根据 340nm/380nm 的比值可以研究钙离子浓度的变化。
仪器数据采集工作方式：磷光
磷光 (寿命 10-3 － 102 秒)
• 需要光源激发 • 激发光源熄灭的情况下测量样品的发射光
Scan 扫描光谱
仪器有两套光栅分光系统，根据激发和发射光栅转动的 形式可形成三种光谱： 激发光谱：激发光栅转动 发射光谱：发射光栅转动
同步光谱：激发和发射光栅同步转动
激发光谱
T e (m im in)
Intensity
3祍 pulse w idth D elay tim e G ate tim e
寿命：单照射，连续采集数据
A + Excitation A* A* A + Emission
G ate tim e
Intensity
T e (m im s)
T e (m im s)
动力学应用（Kinetics application）
测量发射强度随时间的变化，包含： • 荧光Fluorescence • 磷光Phosphorescence • 生化发光Chemi/Bioluminescence 最后得到荧光强度对应时间的谱图，再 用零级、一级、二级公式拟合
寿命测量应用（Lifetimes application）
荧光、磷光产生
Triplet State 三重态 （两个非成对电子 ）
Singlet State 单重态 （成对电子）
S2 T2
3.Intersystem Crossing 体系间跨越
2. Internal Conversio 内部转换
T1
4. Phosphorescence 磷光
S1
1.吸收
3. Fluorescence 荧光
By VarianCD Zuomingfu
硬件原理
光源
单色器
激发
样品
单色器
发射
检测器
Cary Eclipse光路图
发射波长光栅 发射检测器 两套光学系统： 激发和发射
样品
激发波长光栅
光源 激发检测器
发光类型
Luminescence
Photoluminescence Fluorescence Phosphorescence
Light source Monochromator excitation emission Monochromator Sample
发射波长固定，对激发 波长进行扫描
Detector
荧光强度v激发波长
Int
Excitation scan
样品的激发光谱和吸 收光谱相同
发射光谱/荧光光谱
Light source Monochromator excitation emission Monochromator Sample