革胡子鲶基因文库的建构

革胡子鲶基因文库的建构
白俊杰 徐　辉
(中国水产科学研究院珠江水产研究所,热带亚热带鱼类选育与
养殖农业部重点开放实验室,广州510380)
摘　要　以λEM BL 3为载体构建革胡子鲶
(Cla rias ga r iepinus)基因文库。

所得重组子为2
×106　pfu ,达到建库要求的理论值。

关键词　基因文库,革胡子鲶,λEM BL 3载体
分类号　Q
81
革胡子鲶(Clar ias gar iepinus )是国外引进的优良水产养殖品种,它具有生长快、个
体大、耐低氧、产量高、抗病力强等优点。

如果能分离出该鱼的生长激素基因,并将其转入到生长速度较慢,但经济价值高的养殖品种中去,并在这些鱼的体内整合和表达,从而培育出生长快,价值高的新品种。

为此我们选择了革胡子鲶为材料,用λEMBL 3为载体,构建基因文库。

1　
材料与方法
1.1　材　料
革胡子鲶(Cla rias ga riepinus )购于广州鹤洞市场。

E .coli (LE 392);λ噬菌体,溶原菌BHB 2688,BHB 2690;噬菌体EMBL 3　
DN A 。

以上匀取自发育所薛国雄实验室。

限制性内切酶、RN A 酶、T 4DN A 连接酶主要为Boehriger Mannheim 公司产品,部分购自华美生物工程公司。

1.2　方　法
(1)用λEMBL 3载体构建革胡子鲶基因文库的步骤基本按Mania tis 等人的方法进行。

(2)革胡子鲶大分子DN A 的制备按华美公司《分子生物学技术》[1]
方法并参照文献[2]的方法。

(3)15～20kb “目的”DN A 片段的制备按文献[2]的方法用S a u 3A 部分酶切。

蔗糖密度梯度离心分离按文献[3]的方法。

(4)载体EMBL 3双臂的制备按文献[1]中双酶切法并稍加改进。

先将EMBL 3　DN A 在中盐缓冲液中用过量B am H Ⅰ在37℃消化2h,再将缓冲体系调至高盐,用过量的EcoR Ⅰ37℃消化2h 。

常规酚—氯仿抽提、酒精沉淀,溶于TE 中。

-20℃保存。

收稿日期6 本实验在中国科学院发育生物学研究所薛国雄研究员实验室完成,并得到周卫、曹颉及实验室其它同志的大力支持,特此致谢
1997年第1期中山大学学报论丛
SUP PLEM EN T TO T HE J OU RN AL OF SUN YATSEN UNIVER SI TY No.11997
:199-11-01
(5)按文献[2]的方法提取包装蛋白,并对其进行包装效价的测定。

(6)DN A 的连接,体外包装均按文献[1]的方法,设计对照以估计重组体的比例。

(7)基因文库的扩增及保存按文献[1]的方法。

2　
结果与讨论
构建基因文库不仅要有高纯度的DN A,而且要求DN A 有足够大的分子量。

在去蛋白时动作要温和,抽提次数以两层之间的蛋白完全消失来定。

用透析取代酒精沉淀去盐可得到较大分子量的DN A,但DN A 浓度相对要低一些。

本实验所得的样品A 260/A 280=1.89,浓度约为0.38g /L 。

经电泳分析,分子量在100kb 以上。

符合建库的要求。

在实验中,每微克革胡子鲶DN A 用0.02单位Sau 3A 在37℃酶切1h 能得到较大量15～20kb 的DN A 片段。

经蔗糖密度梯度超离心,部分收集,电泳鉴定后,将分子量在15～20kb 的DN A 片段合并,透析去蔗糖后回收。

将回收后的DN A 浓度调在0.2g /L 左右。

在构建高等生物基因文库时,λEMBL 3是一理想的载体。

它可容纳15～20kb 外源的DN A 片段,具有多种特异性的限制酶位点。

利用这一特点,采用双酶切的方法制备双臂。

先用Bam H Ⅰ切下中间片段,再用EcoR Ⅰ切去中间片段与Bam H Ⅰ互补的粘性末端。

这样在连接过程中切下的中间片段就不能与“目的”DN A 片段竞争连接。

此法不但简便,臂的回收率也高。

EMBL 3作为载体的另一优点是当带不同内切酶末端的“目的”DN A 片段重组后消除的内切酶(Bam H Ⅰ)位点,可由邻近位点(Sal Ⅰ)将插入片段切出,回收方便。

Sau 3A 、Mbo Ⅰ、Bgl Ⅱ、Bcl Ⅰ部分酶切DN A 片段均可与Bam H Ⅰ酶切的载体分子相连。

实验所用的两个溶源菌是BHB 2688和BHB 2690,前者缺失E 基因(Eam),后者缺失D 基因(D a m ),二者的任何一个均不能形成成熟的噬菌体。

但两种细菌混合提取物中有正常的E 蛋白和D 蛋白。

重组DN A 分子加入到这种抽提物中,就会装配成噬菌体。

我们提取的包装蛋白效价为1.2×10
17　
pfu /g λDN A,一般认为包装效价要在5×10
16　
pfu /g
λDN A 以上。

连接实验的成功,不但需要质量良好的载体和插入片段,还需要两者在一定比例和浓度下进行。

经过用不同比例进行比较发现当载体DN A 与“目的”DN A 片段的比例在1∶0.2～1∶0.3时连接效果最佳。

连接反应体系中DN A 的浓度与重组率的高低关系很大。

据经验,在10μL 体系中载体的含量不应小于1μg。

表1　连接实验
/μL
实验号
12345载体(0.2g /L )
44
44
4
目的DNA (0.2g /L)00.51 1.5310×缓冲液
11111T 4DNA 连接酶(3/L)11111水
3535载体DN ∶目的DN ∶∶∶∶3∶6总斑数
×3×5
×5
53×5
53×22中山大学学报论丛1997年
4. 2.1A A 1010.110.210.102.4104
2.107.110.10.104
按表1最适条件进行连接包装,我们得到约2.1×106个噬菌体,扣除5%的本底,基因文库中的重组体达2×106　
pfu,根据公式:
N=ln (1-p )/ln (1-f /g )如果插入片段(f )为17kb (15～20kb ),革胡子鲶染色体DN A 为5×108　kb ,那么要使构建的基因文库能以0.99的概率复盖整个革胡子鲶基因组,理论上所需的重组数(N )约为1.36×105。

我们所建的文库的重组子数大大超过这一理论值,符合建库要求。

我们已从此文库中取出一半(约106个重组子)进行扩增,作为永久性保存。

另一半用来直接筛选革胡子鲶生长激素基因,并已初步筛选到该基因的阳性斑。

革胡子鲶基因文库的建成,为鱼类特定基因的分离,用基因工程改良鱼类品种提供了条件。

参考文献
1　分子生物学技术.华美生物工程公司
2　Maniatis T,et al.Molecula r Cloning.A La bora tor y ma nual C.S.H,1992.5453　徐洵,等.DNA 重组技术.北京:科学出版社,1990.99～1004　Clar ke L ,et a l .Cell ,1976,9:
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东莞虎门绿卡实业发展总公司简介
东莞市虎门绿卡实业发展总公司(原虎门金山实业发展总公司)座落于穗、港、澳经济走廊的几何中心、珠江口东岸的重镇——虎门。

公司以17万元创建于1987年。

经过9年的开拓、发展,现拥有资产2.8亿元,下设有6个经济实体,成为集科、教、农、工、贸、旅为一体的“三高”农业企业。

1993年,公司被省科委和国家科委分别确定为省星火基地和国家星火高效农业示范区;1994年又被省市计委、农委、国家计委、农业部确定为“三高”农业试验基地;1995年被国务院发展研究中心确认为“中国最大的中华鳖开发基地”。

绿卡实业发展总公司,以社会需求和民众需要为唯一宗旨,以科技为导向,决心闯出一条高效大农业的路子,力争在2002(公司第三个五年计划末)达到年产值10亿元,利税2亿元的目标。

目前主要产品有绿卡牌中华鳖精、绿卡牌中华全鳖粉、微胶囊矮生中国南瓜精粉、绿卡牌中华鳖系列配合饲料。

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第1期 白俊杰等:革胡子鲶基因文库的建构。