课题1菊花的组织培养

2009年上学期
C、结果分析与评价 1、对接种操作中污染情况的分析
接种3～4 d后，在接种操作中被杂菌污染的 培养物会表现出被污染的现象。适时统计污 染率，分析接种操作是否符合无菌要求。
正常苗
污染苗
2、是否完成了对植物组织的脱分化和再分化
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织， 记录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养 基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和 时间。
3、灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起进行高 压蒸汽灭菌 （二）外植体消毒
1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝 2、消毒
①流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉， 用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗 20min左右。
② 酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入 体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续 6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清 洗。 ③消毒液处理
（六）栽培 幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情 况，适时浇水、施肥，直至开花。
操作的？ ①培养基的灭菌 （高压蒸汽灭菌） ②外植体的消毒 （酒精、氯化汞） ③接种的无菌操作 （酒精、酒精灯——灼烧） ④无菌箱中的培养； ⑤移栽到消过毒的环境中生 存一段时间。
思 考 在整个过程中，是如何来实现无菌
思 考 （P33）
你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2 中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配 方有哪些明显的不同？
微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必 需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持 细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要 是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受 到一定影响后所产生的特殊营养需求。
同一植物材料的年龄、保存时间的长短 会影响实验结果
菊花的组织 培养一般选 择：未开花 植株的茎上 部新萌生的 侧枝。
2、培养基的配制 1962年，Murashinge 和Skoog 在烟草培养 中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。
MS培养基主要成分包括： 大量元素: N、P、K、Ca、Mg、S等 微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co 等 有机物:如氨基酸、烟酸、肌醇、维生素， 蔗糖等
1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根 的韧皮部组织细胞进行悬浮培养，成功诱导 出胚状体并分化为完整的小植株。
思考
植物组织培养的原理是什么？ 植物细胞具有全能性，即已分化的细胞，仍 具有发育成完整个体的潜能。
2、细胞的全能性 ①定义： 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个 体的潜能的特性。 ②原理： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有 的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所 必需的全部基因。
4、接种注意事项 ①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分 数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒 精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种。 ②外植体在培养基中要分布均匀，放置外 植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡 萝卜3－4块，菊花的茎或叶6－8块，也不 要太少，以充分利用培养基中的营养成分 和光照条件。 ③插入时应注意方向，不要倒插。茎段的基 部插入培养基利于吸收水分和养分。
2、配制培养基 ① 配制培养液 配制1LMS培养基，先将称好的琼脂加800ml 蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖 30g，取配制好的大量元素、微量元素、有 机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏 水定容至1000ml。 ② 调PH ③培养基的分装 分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml。 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因 此不必添加植物激素。
2、愈伤组织的继代培养 继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相 同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同 原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组 织的继代培养一代为20d。如果延长时间， 培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒 物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直 径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养， 否则还需进行第二代继代培养 在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打 开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色 可以转为绿色。
大多绿色开花植 物都是靠种子繁殖。 那么，有没有不用 种子来培育植物的 方法呢？
扦插 茎的营养 嫁接 繁殖方式 压条
植物组织培养 当植物细胞脱离了 原来所在的植物器 官或组织处于离体 状态时，在一定的 营养物质、激素或 其它外界条件的作 用下，就可以表现 出全能性，发育成 完整植株。 又称：植物离体培养
思 考
（P33）
你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2 中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配 方有哪些明显的不同？
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的 培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养， 无机盐混合物包括植物生长必需的大量元素 和微量元素两大类。
思 考
高等植物是光能自养型生物，为什么在植 物组织培养过程中还需要提供有机物培养 基？
①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元 素浓缩100倍，常温保存。 ②激素类、维生素类以及用量较小的有机 物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成 母液。 ③用母液配制培养基时，需要根据各种 母液的浓缩倍数，计算用量。
MS固体培养基成分及比例
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湖南长郡卫星远程学校 制作 03 2009年上学期
3、试管苗的培养
当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养 基，进行试管苗的见光培养。 （五）移栽 1、打开封口膜 移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养 瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。 2、清洗转移 用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消 过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间。
3、移栽
幼苗长壮后，移栽到土壤中。
③实例 已分化的植物细胞，仍具有全能性。 高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全 能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全 能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性 所需要的遗传物质。 ④全能性的比较: 受精卵 > 生殖细胞 > 体细胞 分化程度低的细胞 > 分化程度高的细胞 植物细胞 > 动物细胞
3、植物组织培养 ①必要条件： 细胞离体； 一定的营养物质、激素和其他外界条件 ②原理: 细胞的全能性 ③相关概念: 外植体： 从活植物体上切下进行培养的那部 分细胞、组织或器官。
操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械 后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖 好瓶盖。
3、材料的切取和接种 将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精 灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养 皿中切成小段（长约0.5-1cm）。左手持锥 形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将 封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触 瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋 转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段， 放入培养基中。插入时应注意不要倒插。 每瓶接种6－8块外植体。接种后，将封口 膜重新扎好。
分化频率高
③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的 比例对植物细胞发育方向的影响
上述实验结果说明什么问题？
③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的 比例对植物细胞发育方向的影响 生长素 > 细胞分裂素：有利于根的分化 抑制芽的形成
生长素 < 细胞分裂素： 有利于芽的分化， 抑制根的形成 生长素 ＝ 细胞分裂素：促进愈伤组织形成
思 考 （P35）
你打算做几组重复？你打算设置对照实验 吗？ 每种材料或配方至少要做一组以上的重复。 设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有 培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一 同培养，用以说明培养基制作合格，没有被 杂菌污染。
（四）培养 1、愈伤组织的培养
从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。 2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或 黄白色的瘤状愈伤组织。培养愈伤组织时， 恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光 条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成 分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培 养。
4、pH、温度、光照
pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每 日用日光灯照射12h
思 考
植物组织培养过程中为什么需要进行光照？
组织培养过程中，愈伤组织形成根、芽， 直到植株的时候，需要光照。其一，促进 细胞中叶绿素的形成；其二，为光合作用 提供能量。
B、实验操作 （一）制备MS固体培养基 MS培养基包括20多种营养成分，实验室一 般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备 1、配制各种母液 为了避免每次配制培养基都要称量几十种成 分，减少工作量，可以将各种成分按比例配 制成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药 品配成比所需浓度高10－100倍的母液。使 用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释。
4ph温度光照ph控制在58左右温度控制在1822日用日光灯照射12h一制备ms固体培养基ms培养基包括20多种营养成分实验室一般使用4c保存配制好的培养基母液来制备1配制各种母液为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分减少工作量可以将各种成分按比例配制成浓缩液即培养基母液一般将常用药品配成比所需浓度高10100倍的母液
脱分化： 脱分化： 指已经分化的植物器官、组织或 细胞,当受到创伤或进行离体(也受到创伤) 培养时,已停止分裂的细胞,又重新恢复分 裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结 构和功能,成为具有未分化特性的细胞。 再分化： 已经脱分化的细胞在一定条件下, 再分化： 又可经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和 芽,形成完整植株,这一过程叫作再分化。 愈伤组织: 细胞排列疏松而无规则,是高度液 愈伤组织： 泡化的、成无定形状态的薄壁细胞。
此时的组织或细胞是离体的，不能体 现其整个植物体的光能自养,细胞所生 活的环境必须是含有机物的营养环境。
3、植物激素的影响
①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素 生长素类： 2，4－D、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸 细胞分裂素类： 激动素、6－苄基嘌呤、玉米素
②生长素和细胞分裂素作用 植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、 脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存 在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的 趋势。 使用顺序 先使用生长素，后使 用细胞分裂素 先使用细胞分裂素， 后使用生长素 同时使用 实验结果 有利于细胞分裂，但 不利分化 细胞既分裂也分化
取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分， 放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－ 2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂 净消毒液。
外植体消毒强度是不是越大越好？
（三）接种
1、接种室消毒 污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接 种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾 使空气消毒， 酒精或新洁尔灭擦洗工作台 并用紫外线照射20分钟。 2、无菌操作要求
3、是否进行了统计、对照与记录
做好统计和对照，填好结果记录表。从实验 的第一步开始就做好实验记录，可以分组配 制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽 的培养基，然后做不同配方的比较。
4、生根苗的移栽是否合格 生根苗移栽技术的关键是既要充分清洗根系 表面的培养基（离开培养瓶以后，沾有培养 基的根系极易感染细菌，细菌大量繁殖，会 导致烂根）又不能伤及根系。一般使用无土 栽培的办法。培养基质要提前消毒，可以向 培养基质喷洒质量分数为5%的高锰酸钾，并 用塑料薄膜覆盖12 h。掀开塑料薄膜后24 h 才能移栽。新移栽的组培苗要在温室过渡几 天，等壮苗后再定植大田或进行盆栽。可以 在课后统计自己移栽的成活率，看看移栽是 否合格。
课题1 菊花的组织培养
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
A.基础知识
一、植物组织培养的基本过程 1、细胞的分化 概念：在个体发育中，相同细胞的后代在 形态、结构、生理功能上发生稳定 性差异的过程 细胞分化是一种持久性的变化，它发生在生 物体的整个生命过程中。 原因： 在特定的时间和空间条件下基因的 选择性表达的结果 结果： 形成不同的细胞和组织
人参的愈伤组织
菠萝的愈伤组织
④过程: 离 体 组 脱分化 织 或 细胞分 细 裂素≈ 胞 生长素 细胞分裂 素>生长素
愈 再分化 芽 伤 组 根 织 细胞分裂 素<生长素
不需要光
植 物 体
需要光
二、影响植物组织培养的因素 1、植物材料的选择 烟草和胡萝卜的组织培养较为容易 枸杞愈伤组织的芽诱导比较难
课后练习
（P36）
1.植物组织培养所利用的植物材料体积小、 抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物 组织培养的培养基同样适合于某些微生物的 生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养 物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前 功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。
2.外植体的生理状态是成功进行组织培养的 重要条件之一。生长旺盛的嫩枝生理状况好， 容易诱导脱分化和再分化。