17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素对鼻咽癌细胞VEGF和Survivin表达的影响

17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素对鼻咽癌细胞VEGF和
Survivin表达的影响
刘涛
【摘要】目的探讨17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)对人鼻咽癌细胞(HNE1)的影响.方法采用流式细胞技术检测不同浓度(17-AAG)、不同时间处理后HNE1细胞凋亡情况,组织免疫细胞技术检测药物处理后对VEGF、Survivin蛋白表达的影响.结果 17-AAG可以诱导人鼻咽癌细胞的凋亡,且这种作用具有时间和计量依赖性,且可抑制细胞中VEGF、Survivin蛋白的表达.结论热休克蛋白抑制剂17-AAG 具有诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用,对鼻咽癌的临床治疗具有一定的指导意义.
【期刊名称】《延安大学学报（医学科学版）》
【年(卷),期】2011(009)001
【总页数】3页(P1-2,18)
【关键词】17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG);鼻咽癌细
胞;VEGF;Survivin
【作者】刘涛
【作者单位】延安大学附属医院耳鼻咽喉科,陕西,延安,716000
【正文语种】中文
【中图分类】R739.6
热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）是在热诱导下合成的具有高度保守性
质的一组蛋白质，其中HSP90β是热休克蛋白家族中的重要成员，具有重要的生
理功能［1］。

研究表明HSP90β作为抗原肽的载体参与了MHCI类抗原的递呈，在肿瘤免疫中具有重要作用［2］，且与肿瘤的分化程度有关，已成为抗肿瘤治疗研究的靶点。

我们前期的研究发现鼻咽癌组织中HSP90β阳性率高于鼻咽部正常
组织，而且其表达强度与肿瘤分化程度相关，分化程度越低，HSP90β表达越强；HSP90β阴性表达者其5年生存率明显高于阳性者。

目前对于热休克蛋白抑制剂
在抗肿瘤研究方面已有不少的报道［3－4］，17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔
德霉素（17－allylamino－17－demethoxygeldanamyein，17－AAG）是目前进入临床前研究的热休克蛋白抑制剂，具有较好的应用前景，本研究探讨其对人鼻咽癌细胞株影响，以探讨17－AAG在鼻咽癌治疗中的应用。

1.1 材料
鼻咽癌细胞株（HNE1）由四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠，延安大学医学实验中心保存，17－丙烯胺基－17－去甲氧基格尔德霉素（17－AAG）购自Sigma公司，细胞用DMEM培养基、胎牛血清（FCS）及细胞消化液胰酶（Tyrisin）购自美国Gibco BRL公司，Annexin－FITC／PI凋亡试剂盒购自北京三博公司，VEGF、Survivin单克隆抗体购自碧云天生物技术公司，凋亡检测用流式细胞仪使用美国BD公司仪器，荧光倒置显微镜及倒置显微镜均使用日本OLYMPUS公司产品。

1.2 方法
1.2.1 细胞复苏培养从液氮中取出冻存保种的人鼻咽癌细胞株HNE1，迅速置于37℃水浴融化，用培养基洗涤1次。

细胞培养于含10%FCS，100 ug／ml青霉素，100 ug／m l链霉素DMEM培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度无菌条
件下常规培养，每隔2～3 d更换培养基1次。

1.2.2 Annexin－FITC／PI双染法检测细胞凋亡率的变化取处于对数生长期的HNE1细胞，以1×106个／孔接种于6孔培养板。

待细胞贴壁良好后，弃去原细胞培养液，加入17－AAG使药物终浓度分别为100 nM、500 nM、1000 nM，并设立空白对照组（0 nM）。

继续培养24、48、72 h后，收集细胞，500～1000 r／min离心5 min，弃上清，PBS洗2次。

加入500 ul缓冲液重悬细胞，分别加入Annexin－FITC和PI溶液各5 u1、充分混匀、避光室温孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。

1.2.3 免疫组织化学法检测17－AAG对HNE1细胞survivin和VEGF蛋白表达的影响将已处理好的盖玻片放入6孔板内，以1×105／m l细胞的密度接种2 ml 于6孔培养板中，24 h后用上述方法处理细胞，继续培养48 h，处理后500～1000 r／min离心5 min，弃去上清，2 m l PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20 min。

按照试剂盒说明SP法进行免疫细胞化学染色，DNB显色，苏木素复染细胞核。

光镜下阳性细胞细胞膜和细胞质可见棕黄色颗粒，核为紫蓝色。

结果判断：随机取10个视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占比率，阳性细胞比率＝（阳性细胞数／1000）x100%。

2.1 流式细胞术检测HNE1细胞的凋亡率的变化
Annexin－FITC／PI双染法检测结果显示，17AAG处理后48 h，各组细胞的凋亡率分别为，48h对照组凋亡率为1.2%，100、500、1000 nM浓度药物组26.4%、40.2%、52.8%；72 h对照组凋亡率为0.5%，100、500、1000 nM浓度药物组分别为13.5%、19.8%、24.3%，各组与对照组比较差异有统计学意义（见图1），表明17－AAG具有诱导HNE细胞凋亡作用。

2.2 17－AAG对HNE1细胞survivin和VEGF蛋白表达的影响
不同浓度17－AAG处理细胞24 h后，细胞免疫化学结果显示HNE1细胞胞质和胞膜内侧均表达Survivin和VEGF蛋白，呈棕黄色。

对照组细胞胞质和包膜可见
大量棕黄色颗粒，表明Survivin和VEGF蛋白在HNE1细胞中呈强阳性表达。

药
物处理组与对照组比较棕黄色颗粒明显减少，0、100、500、1000 nM等不同浓度处理组中Survivin和VEGF蛋白阳性表达阳性率经统计学分析P＜0.05，差异
有统计学意义（见表1），表明17－AAG抑制了HNE1细胞中Survivin和VEGF 蛋白的，且呈剂量依赖性。

HSP90是一类普遍存在于各种细胞的分子伴侣蛋白，通过调节多种癌蛋白的功能，参与肿瘤细胞的增殖、生存、侵袭、转移和血管生成等多种重要过程的调节。

HSP 家族种类较多，其中HSP90可通过不同作用机制控制细胞凋亡，被认为是抗凋亡伴侣分子。

HER－2／neu、血管内皮生长因子受体（EGFR）、亚稳信号蛋白（Akt、Raf及KK）等［5］被认为是HSP90的客户蛋白，其中多数在肿瘤生长
和转移的信号通路中起着重要作用，是临床确证的抗肿瘤靶点。

通过抑制HSP90
达到降解客户蛋白、诱导肿瘤细胞凋亡、干扰细胞周期、抑制肿瘤侵袭、转移及新生血管生成的效果，从而从多方面抑制肿瘤细胞的生长。

17－烯丙胺基－17－脱甲氧基格尔德霉素（17－AAG）是格尔德霉素的衍生物，可促进恶性肿瘤增殖和存活的多种相关蛋白分解，是第一个进入临床I期试验的HSP90抑制剂，现在已经进入Ⅲ期临床实验。

I期临床结果表明病人对其具有良好的耐受性，对化疗药物耐药的部分患者使用17－AAG仍可以获得良好的效果［6］。

近几年的研究表明17－AAG具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用［7］。

本实验通过流式细胞仪检测凋亡结果亦显示17－AAG具有诱导HNE1细胞凋亡作用，
并初步探讨了其诱导HNE1细胞凋亡的机制，用免疫组化方法检测了药物处理组Survivin及VEGF蛋白的变化，结果显示处理组细胞中Survivin和VEGF蛋白表
达较对照组明显减少，且与药物剂量有相关性，与文献报道一致［8－9］。

本研
究对后续的动物实验及临床研究具有一定的指导意义，为鼻咽癌的治疗提供了新的
方法和思路。

【相关文献】
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