新支流法规程标准[整理版]

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鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊病四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+YBF003株+S-VP2蛋白）00 0
制造及检验试行规程(草案)00
本品系用鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株、H9亚型禽流感病毒YBF003株分别接种易感鸡胚培养、收获感染胚液、超滤浓缩后经甲醛溶液灭活；鸡传染性法氏囊病毒系用表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2（简称S-VP2蛋白）经过发酵培养、诱导表达、菌体破碎、离心去除菌体碎片、提纯、灭活残留细菌；将四种抗原按适当比例混合后加入优质油佐剂，混合乳化制成。

用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感和传染性法氏囊病。

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1 毒种00
1.1 毒种来源制造本品用的鸡新城疫病毒La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株）、鸡传染性支气管炎病毒M41株、传染性法氏囊病病毒BC6-85株（CVCC AV7株）均购于中国兽医药品监察所，由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保管和供应；鸡传染性法氏囊病生产用菌种为表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌，菌株名称为 E.coli BL21/pET28a-VP2（简称S-VP2蛋白）、A型禽流感病毒（H9亚型）A/Chicken/shandong/11/05（H9N2）株（简称YBF003株），由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保存和供应。

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1.2 毒（菌）种标准000
1.2.1 鸡新城疫病毒La Sota株应符合下列标准000
1.2.1.1 对鸡脑内致病指数（ICPI）应为0.1～0.4。

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1.2.1.2 对鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT/MLD）应为103～119小时。

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1.2.1.3 对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～120小时死亡7个，胎儿须有明显充血、出血病痕。

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1.2.1.4 红细胞凝集价按现行《中国兽药典》进行测定，含毒鸡胚液对鸡红细胞凝集价应不低于1:512（微量法）。

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1.2.1.5 病毒含量将含毒鸡胚液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，48小时内死亡的鸡胚弃去不计，在48～120小时内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128（微量法）者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥108.0EID50。

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1.2.1.6 安全性用2～7日龄SPF雏鸡20只，分为两组，第1组10只，每只滴鼻接种5倍稀释的含毒胚液0.05ml；第2组10只，不接种作为对照。

两组在同条件下分别饲养管理，观察10日，应无不正常反应。

如有非特异性死亡，免疫组和对照组均应不超过1只。

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1.2.1.7 免疫原性对30日龄SPF雏鸡滴鼻免疫，最小免疫剂量应≤5000EID50。

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1.2.1.8 特异性将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释（约含
105.0EID50/0.1ml），与等量抗新城疫病毒特异性血清混合，置室温中和1小时后，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种1000倍稀释的病毒液，每胚0.1ml，观察120小时。

在24～120小时内中和组鸡胚应不引起特异性死亡且至少存活8个，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性；对照组鸡胚应至少死亡7个，且鸡胚液作红细胞凝集试验应为阳性。

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1.2.1.9 纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

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1.2.1.10 基础种子代数 E4-1～E4-10代。

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1.2.1.11 毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

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1.2.2 鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611株）应符合下列标准000
1.2.2.1 对鸡最小致死量用2～8月龄SPF鸡4只，各肌肉注射10-7或10-8稀释度的病毒液1ml，14日内应全部死于新城疫。

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1.2.2.2 对鸡胚半数致死量将毒种作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8 3个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，记录接种后
24～72小时死亡且胎儿病痕明显的鸡胚，计算ELD50，每0.1ml病毒含量应
≥107.0ELD50。

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1.2.2.3 纯净性按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

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1.2.2.4 毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

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1.2.3 传染性支气管炎病毒M41株应符合下列标准00
1.2.3.1 对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，鸡胚应于接种后24～144小时内全部或部分死亡。

存活的鸡胚应表现胎儿失水、卷缩、发育小等特异性病痕，其尿囊液对1%鸡红细胞凝集试验应为阴性。

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1.2.3.2 病毒含量每0.1ml 病毒含量应不低于106.0EID50。

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1.2.3.3 对雏鸡的毒力用1～7日龄SPF鸡10只，每只以10倍稀释的毒种滴鼻1～2滴（0.025～0.050ml），观察10日，至少应有8只出现鸡传染性支气管炎的典型症状。

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1.2.3.4 特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍（含104.0EID50/0.1ml），与等量鸡抗传染性支气管炎特异性血清混合，置室温中和1小时后，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种100倍稀释的毒液，每胚0.1ml，观察至144小时。

在24～144小时内中和组鸡胚应无特异性死亡及鸡胚病变，对照组鸡胚死亡和出现特异性病变的胎儿总数应至少8个。

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1.2.3.5 免疫原性将毒种接种10日龄SPF鸡胚繁殖，取病毒含量≥106.0EI D50/0.1ml的鸡胚液，灭活后按1:3（水相:油相）的比例制成灭活疫苗。

用14～42日龄SPF鸡25只，20只各点眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗（H120株）1羽份（0.05ml），另5只不接种作为对照。

接种后21～28日，分别采血，分离血清，再颈部皮下或肌肉接种灭活疫苗0.3ml/只，第二次接种后21～28日，再分别采血，分离血清，将两次血清分别作HI抗体效价测定。

免疫组二免血清HI 抗体效价的几何平均值（GMT）应较首免血清高4倍以上，对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:8（微量法）。

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1.2.3.6 纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原
体及外源病毒污染。

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1.2.3.7 基础种子代数 E1～E6代。

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1.2.3.8 毒种保存在-70℃以下保存，有效期为72个月。

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1.2.4 禽流感病毒YBF003株应符合下列标准00
1.2.4.1 对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10000倍稀释(约含103.0EID50/0.1ml),尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，在接种后60～120小时内，应至少有8个鸡胚死亡。

胎儿应表现全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。

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1.2.4.2 对雏鸡的毒力将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，经翅静脉接种28～56日龄SPF鸡10只，每只0.2ml，接种后14日内，应不出现死亡或明显异常反应；接种后3～5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子，经处理后，分别经尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的红细胞凝集价不低于1:16（微量法），即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。

应至少9只鸡病毒分离阳性。

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1.2.4.3 病毒含量将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8 3个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在24～120小时内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16(微量法)者判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量应≥107.0EID50。

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1.2.4.4 红细胞凝集价（HA）毒种对鸡红细胞凝集价（HA）应不低于1:256(微量法)。

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1.2.4.5 毒种特异性000
1.2.4.5.1 血凝抑制试验毒种与抗H9亚型禽流感病毒特异性血清应为阳性反应，与SPF鸡血清、禽流感（H5、H7亚型）阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清均应为阴性反应。

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1.2.4.5.2 鸡胚中和试验将毒种用灭菌生理盐水作1000倍稀释，与等量
抗H9亚型禽流感病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种1000倍稀释的病毒液，每胚0.1ml，观察120小时。

在24～120小时内中和组鸡胚应无特异性死亡，且应至少有9个健活，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性反应；对照组鸡胚应至少有8个死亡，且鸡胚液作红细胞凝集试验均应为阳性反应。

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1.2.4.6 免疫原性取红细胞凝集价不低于1:256(微量法)的鸡胚液，灭活后按1:3（水相:油相）的比例制成灭活疫苗，颈部皮下接种21～28日龄SPF 鸡10只，每只0.2ml，另取10只不接种作为对照。

21日后采血，分离血清，测定HI抗体效价，同时翅静脉注射10倍稀释的YBF003株病毒液，每只0.2ml，于攻毒后3～5日采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16（微量法），即可判为病毒分离阳性。

对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。

免疫组血清HI抗体效价的几何平均值应不低于1:180（微量法），且病毒分离至少9只为阴性；对照组血清HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4（微量法），且病毒分离至少9只为阳性。

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1.2.4.7 纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

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1.2.4.8 基础种子代数 E5～E15代。

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1.2.4.9 毒种的保存在-70℃以下保存，有效期为60个月。

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1.2.5 表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌（S-VP2蛋白）应符合下列标准00
1.2.5.1 形态和生化特性培养物涂片为革兰氏阴性短杆菌，可成短链状，在不良的培养条件下可呈现长丝状。

埃希氏大肠杆菌分解葡萄糖，产生的二氧化碳和氢气大约相等；在蛋白胨肉汤中产生吲哚；在0.5%葡萄糖肉汤中，于37℃培养4日后，培养基的pH值低于4.5，甲基红试验呈阳性反应；Voges-Proskauer 二氏反应（V.P.反应）阴性；枸橼酸盐试验阴性。

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1.2.5.2 培养特性 LB固体培养平板上的形状为圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落。

在加有卡那霉素的培养基中能生长。

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1.2.5.3 鉴别检验000
(1)PCR检测（检测VP2是否表达）在LB固体培养平板上挑取单菌落，加100µl灭菌双蒸水，沸水浴5分钟后，用自备PCR引物扩增VP2基因全片段或部分片段。

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使用以下引物进行单菌落DNA扩增能得到约1400bp的扩增片段。

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引物1 5′-CCG AAT TCA TGA CAA ACC TGC AAG ATC-3′000
引物2 5′-GGA AGC TTT CCT TAT GGC CCG GAT TAT G-3′000
使用以下引物扩增能得到222bp的DNA片段。

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引物1 5′-ACA GAT TGT TCC GTT CAT ACG-3000
引物 2 5′-TCG AAC TTG TAG TTC CCA TTG-3’000
(2)琼脂扩散试验（AGP,检测表达的VP2蛋白是否有活性）将LB固体培养平板上的工程菌单菌落接种于LB液体培养基中，培养至OD600值在0.6～1.0之间时加入0.2mol/L α乳糖，至终浓度为0.02mol/L，持续培养5～8小时，收集菌体，超声破碎，8000rpm离心去沉淀，上清液与抗鸡传染性法氏囊病毒特异性血清进行AGP试验，应出现特异的沉淀线。

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1.2.5.4 免疫原性将AGP效价不低于1∶16的表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的基因工程菌液灭菌后按1∶3（水相∶油相）的比例制成灭活疫苗。

取21～28日龄SPF鸡20只，其中10只各接种疫苗0.2ml，另10只不接种作为对照，同条件下隔离饲养。

接种后21～28日，所有免疫鸡和对照鸡经点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液，0.1ml/只(实含毒量≥100个BID)。

攻毒后，每日观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。

免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病病变；对照鸡应至少8只发病，出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。

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1.2.5.5 菌种传代取标准保藏菌种管，进行管外表面消毒后打开，加入LB培养液少许，用接种棒在加有卡那霉素的LB培养平板上划线。

倒置后37℃培
养24小时，挑取单菌落，转接于加有卡那霉素的LB培养液中，37℃振荡培养16～18小时。

然后用接种棒在加有卡那霉素的平板或斜面上划线，37℃培养20小时。

封口后，2～8℃保存（10日）。

再从平板上挑取单菌落，按上述方法继续传代。

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1.2.5.6 纯粹用适宜培养基检查，应纯粹。

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1.2.5.7 菌种代次基础种子代数1～20代，一级种子继代应不超过4代。

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1.2.5.8 保存培养物冻干保存，-20℃下有效期为24个月。

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1.2.6 强毒标准鸡传染性法氏囊病毒BC6-85株（CVCC AV7株）应符合下列标准。

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1.2.6.1 对鸡的感染量将种毒作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别点眼接种28～42日龄SPF鸡，0.1ml/只。

攻毒后每天观察鸡只的临床表现及死亡情况，记录发病和死亡鸡数，剖检观察死亡鸡法氏囊等病变，至96小时扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变，以法氏囊肿大、萎缩、发炎、有分泌物等任一项临床表现，判为感染。

最小感染量（BID）应≥10-4.0/0.1ml。

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1.2.6.2 特异性将毒种用灭菌生理盐水稀释至105.0ELD50∕0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病特异性血清混合，置室温中和1小时，以绒毛尿囊膜途径接种10～12日龄SPF鸡胚10个，每胚接种0.2ml；同时设病毒对照10个，每胚接种病毒液0.1ml（含105.0ELD50∕0.1ml），同条件观察168小时。

在24～168小时内中和组鸡胚应全部健活，对照组鸡胚至少死亡9个，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验（HA）应均为阴性。

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1.2.6.3 纯净检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

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1.2.6.4 保存在-20℃以下保存，有效期为24个月。

在-70℃以下保存，有效期为60个月。

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2 疫苗制造及半成品检验000
2.1 生产用毒种制备000
2.1.1 鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种制备000
2.1.1.1 毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），
尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。

选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。

将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:512（微量法）的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。

注明收获日期、毒种代次等。

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2.1.1.2 毒种鉴定按1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.5、1.2.1.8和1.2.1.9项进行，应符合规定。

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2.1.1.3 毒种保存在-15℃以下，应不超过6个月。

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2.1.1.4 毒种继代应不超过3代。

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2.1.2 鸡传染性支气管炎病毒M41株生产用毒种制备00
2.1.2.1 毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-2～10-3），尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。

选接种后30～48小时内死亡的鸡胚及48小时存活的鸡胚胚液（尿囊液及羊水），装于无菌容器内。

将检验无菌、病毒含量≥106.0EID50/0.1ml、对1%鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。

注明收获日期、毒种代次等。

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2.1.2.2 毒种鉴定按本试行规程1.2.
3.1、1.2.3.2、1.2.3.4、1.2.3.6项进行，应符合规定。

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2.1.2.3 毒种保存在-15℃以下保存，应不超过6个月。

00
2.1.2.4 毒种继代应不超过3代。

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2.1.3 禽流感病毒YBF003株毒种制备000
2.1.
3.1 毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或10-4）,尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚,每胚0.1ml。

选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚,分别收获鸡胚液(尿囊液及羊水),装于灭菌容器内。

将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:256（微量法）的鸡胚液混合,定量分装于安瓿中,冷冻保存，注明收获日期、毒种代次等。

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2.1.
3.2 毒种鉴定按1.2.
4.1、1.2.4.3、1.2.4.4、1.2.4.5、1.2.4.7项进行,应符合规定。

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2.1.
3.3 毒种保存在-15℃以下，应不超过6个月。

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2.1.
3.4 毒种继代应不超过3代。

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2.1.4 表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生产用菌种制备00
2.1.4.1 一级种子繁殖和鉴定将各株冻干菌种分别接种于加卡那霉素的LB液体培养基中，35～36℃培养 24小时，然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养，选取符合1.2.5.2项标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于LB琼脂斜面若干支、置35～36℃培养20～24小时，作为一级种子。

在2～8℃保存，不超过14日；在培养基上传代，应不超过4代。

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2.1.4.2 二级种子繁殖取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中，35～36℃培养20～24小时。

置2～8℃保存，应不超过3日。

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2.2 制苗材料选择鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感病毒液的制备，选择发育良好的10～11日龄易感鸡胚作为制苗材料。

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌的培养基为改良LB培养基，见附注。

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2.3 制苗用病毒液的制备000
2.3.1 鸡新城疫病毒液的制备00
2.3.1.1 接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10-5），按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

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2.3.1.2 孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。

此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

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2.3.1.3 收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。

凝集价低于1:256（微量法）者应弃去。

同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

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2.3.1.4 浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:2048（微量法）时停止浓缩，按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

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2.3.1.5 灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

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2.3.2 鸡传染性支气管炎病毒液的制备00
2.3.2.1 接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-2或
10-3），按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

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2.3.2.2 孵育和观察鸡胚接种后24小时照胚1次，弃去死胚。

此后每4小时照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至48小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃中冷却12～24小时。

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2.3.2.3 收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样检测病毒含量，应≥106.0EID50/0.1ml。

同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

00
2.3.2.4 浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

000
2.3.2.5 灭活将传染性支气管炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

00
2.3.3H9亚型禽流感病毒液的制备00
2.3.3.1 接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-3或
10-4），按《全自动接种机使用说明》要求，接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

00
2.3.3.2 孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将48小时前死亡的鸡胚弃去。

此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无
论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

00 0
2.3.3.3 收获将冷却的鸡胚取出，按《全自动收获机使用说明》要求，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。

吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。

凝集价低于1:256（微量法）者应弃去。

同时按《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。

收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

00
2.3.3.4 浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩4倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:1024（微量法）时停止浓缩。

按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无细菌生长，并留样备测毒价。

浓缩后的胚液随即进行灭活。

00
2.3.3.5 灭活将H9亚型禽流感病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。

加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。

37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

00
2.3.4 鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备000
2.3.4.1 菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基及花生油消泡剂。

灭菌后按培养基量的2％～4％接种二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。

开始小量通气，逐渐增大气量。

000
2.3.4.2 破菌培养结束后，离心收集菌体。

收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量 PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。

破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。

经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液随即进行灭活。

00
2.3.4.3 灭菌将收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，然后将胚液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时（以罐内液体温度达到37℃开始计时），以灭活残存的大肠杆菌及毒素。

2～8℃保存，不超过7日；-15℃以下保存，不超过60日。

00
2.4 半成品检验000
2.4.1 鸡新城疫病毒液000
2.4.1.1 无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

000
2.4.1.2 灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异死亡应不超过1个。

对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

000
2.4.1.3 红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价不低于1:2048（微量法）者，方可用于制苗。

00 0
2.4.1.4 病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1m1，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128（微量法）者，判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量≥108.7EID50的胚液，方可用于制苗。

000
2.4.2 传染性支气管炎病毒液00
2.4.2.1 无菌检验取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

000
2.4.2.2 灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，鸡胚非特异性死亡应不超过1个。

对所有鸡胚进行检验，应均不出现失水、卷缩、发育小等现象。

将胚液收获再盲传一代，仍不出现失水、蜷缩、发育小等现象时，认为灭活完全。

000
2.4.2.3 病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-5、10-6和10-7 3个稀释度，分别尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，每日照胚2次，观察6日。

6日后收取鸡胚，无论死胚、活胚（接种后24小时内死亡者除外）均称重观察鸡胚病变，其胎儿具有失水、卷缩、发育小(接种胎儿重量比对照胚最轻胎儿重量少2克以上)等特异性病痕者，判为感染，计算EID50。

每0.1ml病毒含量≥106.7EID50，方可用于制苗。

000
2.4.3 H9亚型禽流感病毒液00
2.4.
3.1 无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

000
2.4.
3.2 灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活浓缩胚液，每个0.2ml，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价时，认为灭活完全。

000
2.4.
3.3 红细胞凝集价测定将浓缩后灭活前的胚液测定红细胞凝集价，凝集价不低于1∶1024（微量法）者，方可用于制苗。

00
2.4.
3.4 病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-83个稀释度，各尿囊腔内接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1m1，置36～37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:16（微量法）者，判为感染，计算EID50，每0.1ml病毒含量≥107.7EID50时,方可用于制苗。

000
2.4.4 鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白000
2.4.4.1 VP2含量检测将制苗用VP2蛋白液按“附注3”方法进行琼脂扩散试验，上清液中表达产物VP2的滴度（AGP效价）不低于1:64者，方可用于制苗。

000
2.4.4.2 无菌检验按《中国兽药典》进行，应无菌生长。

000
2.4.4.3 内毒素检测将灭菌后的VP2蛋白液按“附注4”方法进行内毒素检测，内毒素含量不高于1000EU/ml者（用内毒素＜0.125EU/ml的氯化钠注射液将VP2蛋白稀释1000倍，鲎试剂盒检测为阴性），方可用于制苗。

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2.5 疫苗的制备000
2.5.1 油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

000
2.5.2 水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、H9亚型禽流感病毒液、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白按适当比例混合
（1:1:1:1）。

使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.0EID50，鸡传染性支气管炎病毒含量不低于106.0EID50，H9亚型禽流感病毒含量不低于107.0EID50；传染性法氏囊病毒上清液中VP2蛋白的含量不低于1∶16（与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价）。

取灭菌后的吐温-80 4份，加入配液罐中，同时加混。