同步导数荧光光谱法测定尿样中的痕量氧氟沙星

第21卷,第3期 光谱学与光谱分析Vol 121,No 13,pp3562358
2001年6月 Spectroscopy and Spectral Analysis
J une ,2001　
同步2导数荧光光谱法测定尿样中的痕量氧氟沙星3
弓巧娟1,2 杜黎明1 晋卫军13
3
董　川1 刘长松1
1山西大学化学系,030006　太原2
运城高等专科学校,044000　运城
摘　要　尿样中内源激素等物质发射强的荧光,严重干扰氧氟沙星的测定。

经过同步和一阶导数处理,很
好地分辨了尿样背景和氧氟沙星的荧光信号。

据此提出了尿样中痕量氧氟沙星含量测定的同步2导数荧光光谱法。

测定样品的线性范围为:0136～316μg ・mL -1,检测限0130μg ・mL -1,回收率101%～103%,相对标准偏差小于215%。

主题词　氧氟沙星,　同步2导数荧光光谱法,　尿样
　1999207221收,2000201211接受;3国家自然科学基金(No 129875016)和山西省自然科学基金资助课题　33通信联系人
　弓巧娟,女,1962年生,硕士,现为运城高等专科学校副教授
前 言
氧氟沙星(OFL X )属第三代喹诺酮类药物,为DNA 螺旋酶抑制剂,同时还有破坏细胞膜导致细胞内溶物外溢的作用。

由于其独特的作用机理,使之具有抗菌谱广、抗菌活性强、生物利用度好、毒副作用小等优点[1],因而广泛应用于临床。

研究表明,该药通过肾脏排泄,大部分以原形由尿液中排出。

因此测定尿液中的OFL X 含量在临床和药代动力学研究方面是十分必要的。

OFL X 含量测定的方法多有文献报道[2～4],其中对尿液中的OFL X 含量的测定方法研究较多的有分光光度法[5,10]、HPLC 法[6,7]和荧光分光光度法[8]等。

这些方法仍然存在着不同程度的弱点,如背景干扰较大、检测限不够低、分析成本较高等。

而同步2导数荧光技术具有好的选择性,从而能有效地消除背景干扰,降低检测限。

本文研究发现尿样中内源激素的荧光与OFL X 的荧光光谱重叠较为严重。

但经同步2导数处理后,完全排除了尿样背景干扰,据此建立了人体尿液中痕量OFL X 测定的同步2导数荧光光谱法。

该方法操作简单,选择性好,灵敏度高。

1　实验部分
111　仪器与试剂
日立F 24500荧光光度计,激发/发射通带215nm 。

p Hs 22型酸度计。

氧氟沙星(OFL X )(中国药品生物制品检定所提供),于105℃干燥至恒重,用二次蒸馏水加适量011mol ・L -1NaOH 溶液,配成5×10-3mol ・L -1储备液,使用时逐级稀释至所需浓度。

不同p H 的缓冲溶液分别用KCl 2HCl 、
NaAc 2HAc 、NH 4Ac 2NaOH 、Na 2B 4O 72NaOH 配制。

所用试剂
均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

112　实验方法
于5mL 容量瓶中加入一定量的OFL X 标准溶液,用不同p H 的缓冲溶液定容至刻度,摇匀,用石英荧光池,于荧光光度计上,分别进行激发和发射光谱扫描。

2　结果与讨论
211　pH 对激发和发射光谱以及发光强度的影响
由图1可见,在p H
为3的酸性介质中,其最大激发和发射波长分别为300和501nm 。

激发光谱中还有两个肩峰,分别位于245和348nm 。

Fig 11　Excitation and emission spectra
p H =3,[OFL X]=5×10-5mol ・L -1
OFL X 分子中含有羰基、胺基和羧基,它们在不同酸碱
溶液中的质子化和去质子化作用将直接影响着发光体系的电子云分布,继而影响体系的荧光性质。

采用KCl 2HCl 、NaAc 2HAc 、NH 4Ac 2NaOH 和Na 2B 4O 72NaOH 分别控制溶液
的p H 值进行荧光激发和发射扫描,由图2可见,OFL X 荧光强度受p H 的影响非常显著。

随着p H 值的增大,OFL X 的荧光强度逐渐增加,p H 值达到3左右时荧光发射最强。

继续增加溶液的碱性,荧光强度呈减小趋势。

不仅如此,其激发和发射波长也随p H 变化,在p H 1～5发射波长蓝移8nm ,p H 5～7,蓝移33nm ,p H 7～11发射波长变化不大。

激发波长在p H 1～5、p H 7～11基本无变化,p H 5～7,蓝移17nm 。

故实验选择最佳p H 311。

图2中荧光强度为相应p H 条件下的最大发射。

Fig 12　The effect of pH on fluorescence intensity
[OFL X]=2×10
-5
mol ・L
-
1
Fig 13　Fluorescence emission spectra
a 1尿样背景,
b 1OFL X
[OFL X]=2×10-5mol ・L -1,p H =31
1
Fig 14　Synchronous fluorescence spectra
a 1尿样,
b 1OFL X 与尿样的混合物[OFL X]=6×10-6mol ・L -1,p H =311
212　同步2导数荧光光谱
取一定量的OFL X 与空白尿样的混合物,按实验方法分别对其进行荧光发射光谱、同步荧光光谱和一阶导数同步荧光光谱扫描。

其结果见图3～图5。

Fig 15　First order derivation 2synchronous
fluorescence spectra
a 1尿样,
b 1OFL X 与尿样的混合物[OFL X]=2×10-5mol ・L -1,p H =311
由图3可知,OFL X 与空白尿样的发射波长分别为500
和415nm 。

尿液中的本底荧光物质(内源激素等)与OFL X 荧光发射光谱互相重叠,严重干扰荧光测定。

同步荧光光谱(图4)虽较荧光光谱有较好的分辨率,但即使所测荧光物质含量较高,尿样的本底荧光干扰仍不能完全排除。

而一阶导数2同步荧光光谱对OFL X 和内源激素有良好的分辨率,结果见图5。

由图可知OFL X 的波峰和波谷分别位于300、336和381nm 。

在381nm 峰谷处,尿样背景的干扰已基本消除。

实验时选择381nm (波谷)采用峰零法进行OFL X 定量测定。

213　Δλ的选择Δλ值的选择在同步荧光光谱法中占重要地位,其合适
与否直接影响到方法的灵敏度与选择性[9],分别实验了Δλ值为30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130nm 时混合组分的同步2导数荧光光谱,结果表明,Δ
λ=80nm 时,OFL X 与尿液中的本底荧光物质的分辨率最好,荧光信号最大。

214　工作曲线与检测限
于若干5mL 容量瓶中分别加入稀释一定倍数的尿液和
一定量的OFL X ,选择Δ
λ=80nm ,在激发波长为200～450nm 范围内分别对以上系列OFL X 与尿样混合液进行同步2导数荧光光谱扫描,选择381nm 波长,用峰零法测定同步一阶导数值。

结果表明,OFL X 的浓度在0136～316μg ・mL -1范围内与一阶导数值具有良好的线性关系,其线性回归方程为:d F/d λ=-3105×106c OFLX -01807(c :mol ・L -1),r =01999。

根据信噪比S/N =3确定被测物质的检出限为0130μg ・mL -1。

215　样品测定
将口服奥复星(OFL X 片)健康受试者尿液准确稀释一定倍数,精确量取015mL ,置于5mL 容量瓶中,用p H =311的缓冲液稀至刻度,按上述工作曲线操作步骤进行同步
7
53第3期 光谱学与光谱分析
2导数荧光光谱扫描,将采用峰零法测定的结果代入线性回
归方程,计算尿样中OFL X的含量,同样对其加样回收率进
行测定。

结果见表1。

T ab11　Analytical resutls of samples(n=5)
样品测得量/(μg・mL-1)平均值/(μg・mL-1)标准加入量/(μg・mL-1)测定总量/(μg・mL-1)平均值/(μg・mL-1)回收率(%)RSD(%)
尿样1#1127,1131,1133,
1128,1130
1130118
1108
2136,2142,2146,
2139,2140
2141103115
尿样2#2136,2124,2126,
2128,2136
2136214
1108
3145,3133,3135
3137,3145
3139101117
尿样3#1122,1124,1123
1125,1124
1124112
1108
2132,2136,2132
2141,2133
2135101117
11尿样1#,2#,3#分别为健康受试者按临床剂量口服奥复星(OFLX片)2h、4h和6h后取样的结果。

21表1测得量分别为尿样1#,2#,3#中OFLX含量的测得值,RSD分别为118%,214%,112%;测定总量分别为尿样1#,2#,3#中各加入1108μg・mL-1 OFLX后的测得值,RSD分别为115%,117%,117%。

回收率101%～103%。

测定结果表明:服药后4h尿药浓度最高。

参考文献
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　2　M R Lockley,R Wise.J.A nti microb.Chemother.,1984,14:647
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　6　G Carlucci,S Guadagni and G Palumbo.J.L iq.Chromatogr.,1986,9(11):2539
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　10　Yuhong TAN G et al(唐玉红等).S pect roscopy and S pect ral A nalysis(光谱学与光谱分析),1996,16(6):120 Determination of Ofloxacin in U rine by Synchronous2Derivative Fluorimetry
Qiaojuan G ON G1,2,Liming DU1,Weijun J IN1,Chuan DON G1and Changsong L IU1
1Depart ment of Chemist ry,S hanxi U niversity,030006　Taiyuan
2Y uncheng A dvanced T raining College,044000　Y uncheng
Abstract　The internal hormones in human urine emit strong fluorescence and interfere with the determination of trace ofloxacin.How2 ever,the experiments indicate that synchronous2first order derivative fluorimetry can be applied to the determination of trace ofloxacin without interference.The linear range is0136—316μg・mL-1,detection limit is013μg・mL-1,RSD is less than215%and the recov2 ery is within the range of101%—103%.
K eyw ords　Ofloxacin,　Synchronous2derivative fluorimetry,　Urine
(Received J uly21,1999;accepted Jan.11,2000) 853 光谱学与光谱分析 第21卷。