乌梅总黄酮对MPP+诱导SH

㊃论 著㊃ d o i :10.3969/j
.i s s n .1671-8348.2022.12.001网络首发 h t t p
s ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /50.1097.r .20220124.1942.017.h t m l (2022-01-26)乌梅总黄酮对M P P +
诱导S H -S Y 5Y 细胞
线粒体损伤的保护作用
*
王春玲1,罗 宁2,文晓东2ә,蒋媛静2,刘 钰2,冯文勇2
(1.广西中医药大学药学院,南宁530200;2.广西中医药大学附属瑞康医院神经内科,南宁530011
) [摘要] 目的 探讨乌梅总黄酮(F M F )对神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(M P P +
)诱导人神经母细胞瘤(S H -S Y 5Y )细胞建立的帕金森病(P D )细胞模型钙调蛋白激酶(C a MK K β
)/腺苷酸活化蛋白激酶(AM P K )通路的调控作用及对S H -S Y 5Y 细胞线粒体功能的影响㊂方法 250μm o l /L M P P +
作用于S H -S Y 5Y 细胞24h
后,建立P D 体外细胞模型,将细胞分为5组:对照组(只加S H -S Y 5Y 细胞,不加药物)㊁模型组(250μm o l /L
M P P +
孵育24h )㊁F M F 低剂量组(M P P ++F M F 10μm o l /L )㊁F M F 中剂量组(M P P +
+F M F 50μm o l /L )
和F M F 高剂量组(M P P +
+F M F 100μm o l /L )㊂C C K -8法检测细胞的存活率,J C -1染色检测线粒体膜电位
(ΔΨm );W e s t e r n b l o t 检测C a MK K β/AM P K 信号通路相关C a MK K β㊁AM P K 及磷酸化C a MK K β(
p -C a MK K )㊁磷酸化AM P K (p
-AM P K )表达水平㊂结果 C C K -8检测结果显示,F M F 预处理24h 后,F M F 低㊁中㊁高剂量组M P P +
损伤细胞的存活率均较模型组明显升高(P <0.05或P <0.01)
㊂ΔΨm 检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞ΔΨm 明显降低(P <0.001);与模型组相比,F M F 低㊁
中㊁高剂量组ΔΨm 明显升高(P <0.001)㊂W e s t e r n b l o t 检测结果显示,与对照组比较,模型组p -C a MK K β
㊁p -AM P K 表达水平均明显下降(P <0.01);与模型组比较,F M F 低㊁中㊁高剂量组p -C a MK K β
㊁p -AM P K 表达水平均明显上调(P <0.05或P <0.01)㊂F M F 干预前㊁后各组间C a MK K β
㊁AM P K 表达水平比较,差异均无统计学意义(P >0.05)㊂结论 F M F 可减轻M P P +
对S H -S Y S Y 细胞的损伤,这种保护作用可能是通过激活C a MK K β
/AM P K 通路,改善线粒体功能实现的㊂
[关键词] 帕金森病;乌梅总黄酮;1-甲基-4-苯基吡啶离子;钙调蛋白激酶;腺苷酸活化蛋白激酶;线粒体[中图法分类号] R 284.141
[文献标识码] A
[文章编号] 1671-8348(2022)12-1981-06
P r o t e c t i v e e f f e c t o f f r u c t u s m u m e t o t a l f l a v o n e o n m i t o c h o n d r i a l d a m a g
e i n d u c e d b y M P
P +
i n S H -S Y 5Y c e l l s *
WA N G C h u n l i n g 1
,L U O N i n g 2,WE N X i a o d o n g 2ә,J I A N G Y u a n j i n g 2,L I U Y u 2,F E N G W e n y o n g 2
(1.S c h o o l o f P h a r m a c y ,G u a n g x i U n i v e r s i t y o f C h i n e s e M e d i c i n e ,N a n n i n g ,G u a n g
x i 530200,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f N e u r o l o g y ,R u i k a n g H o s p i t a l A f f i l i a t e d t o G u a n g x i U n i v e r s i t y o f
C h i n e s e M e d i c i n e ,N a n n i n g ,G u a n g
x i 530011,C h i n a ) [A b s t r a c t ] O b j
e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e
f f e c t o f f r u c t u s m u m e t o t a l f l a v o n e (F M F )o n t h e r e
g u l a t i o n o f c a l m o d u l i n k i n a s e /a d e n o s i n e m o n o p
h o s p h a t e a c t
i v a t e d p r o t e i n k i n a s e (C a MK K β
/AM P K )p a t h w a y i n h u -m a n n e u r o b l a s t o m a (S H -S Y 5Y )c e l l s i n d u c e d b y n e u r o t o x i n 1-m e t h y l -4-p h e n y l p y r i d y
l i o n (M P P +
),a c e l l m o d e l o f P a r k i n s o n s d i s e a s e (P D ),a n d t h e m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n i n S H -S Y 5Y c e l l s .M e t h o d s S H -S Y 5Y
c e l l s w e r e t r e a t e
d w i t h 250μm o l /L M P P +
f o r 24h ,a n d a n i n v i t r o m o d e l o f P D w a s e s t a b l i s h e d .T h e c e l l s
w e r e d i v i d e d i n t o 5g r o u p s :t h e c o n t r o l g r o u p (o n l y a d d e d S H -S Y 5Y c e l l s ,w i t h o u t a n y d r u g ),t h e m o d e l g r o u p
(250μm o l /L M P P +i n c u b a t e d f o r 24h ),a n d t h e F M F l o w -,m e d i u m -,a n d h i g h -d o s e g r o u p
s (M P P +
+10,50,100μm o l /L F M F ,r e s p e c t i v e l y ).C C K -8a s s a y w a s u s e d t o d e t e c t t h e c e l l s u r v i v a l r a t e ,J C -1s t a i n i n g w
a s u s e d 1
891重庆医学2022年6月第51卷第12期*
基金项目:国家自然科学基金项目(82060888);广西中医药管理局立项项目(G Z Z C 2020107);2018广西中医药大学一流学科项目
(2018X K 089);广西中医药大学2020年校级课题(2020M S 049)㊂ 作者简介:王春玲(1974-),讲师/助理研究员,博士,主要从事中药防治神经退行性疾病研究㊂ ә 通信作者,E -m a i l :w e n x i a o d o n g
0912d r @163.c o m ㊂
t o d e t e c t t h e c h a n g e o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l(ΔΨm),W e s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x-p r e s s i o n l e v e l s o f C a MK Kβ/AM P K s i g n a l i n g p a t h w a y r e l a t i v e p r o t e i n s C a MK Kβ,AM P K,p h o s p h o r y l a t e d C a MK Kβ(p-C a MK K)a n d p h o s p h o r y l a t e d AM P K(p-AM P K).R e s u l t s T h e r e s u l t s o f C C K-8s h o w e d t h a t a f t e r F M F p r e t r e a t m e n t f o r24h,t h e s u r v i v a l r a t e o f M P P+d a m a g e d c e l l s i n t h e F M F l o w-,m e d i u m-,a n d h i g h-d o s e g r o u p s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n t h e m o d e l g r o u p(P<0.05o r P<0.01).T h e r e s u l t s o f ΔΨm t e s t s h o w e d t h a t,c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l g r o u p,t h eΔΨm o f c e l l s i n t h e m o d e l g r o u p w a s d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.001).C o m p a r e d w i t h t h e m o d e l g r o u p,t h eΔΨm o f c e l l s i n t h e F M F l o w-,m e d i u m-,a n d h i g h-d o s e g r o u p s w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.001).W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f r e l a t e d p r o t e i n s s h o w e d t h a t,c o m p a r e d w i t h t h e c o n t r o l g r o u p,t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f p-C a MK Kβa n d p-AM P K w e r e s i g n i f i c a n t l y r e-d u c e d i n t h e m o d e l g r o u p(P<0.01).C o m p a r e d w i t h t h e m o d e l g r o u p,t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f p-C a MK Kβ
a n d p-AM P K w e r e s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n t h e F M F l o w-,m e d i u m-,a n d h i g h-d o s e g r o u p s(P<0.05o r P<
0.01).T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f C a MK Kβa n d AM P K b e f o r e o r a f t e r
F M F p r e t r e a t m e n t(P>0.05).C o n c l u s i o n F M F c a n a l l e v i a t e t h e d a m a g e o f M P P+t o S H-S Y S Y c e l l s,a n d t h i s p r o t e c t i v e e f f e c t m a y b e a c h i e v e d b y a c t i v a t i n g t h e C a MK Kβ/AM P K p a t h w a y a n d i m p r o v i n g m i t o c h o n-d r i a l f u n c t i o n.
[K e y w o r d s] P a r k i n s o n s d i s e a s e;f r u c t u s m u m e t o t a l f l a v o n e;1-m e t h y l-4-p h e n y l p y r i d i n i u m;C a2+/c a l m-o d u l i n d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e k i n a s e;a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e-a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e;m i t o c h o n d r i o n
帕金森病(P a r k i n s o n's d i s e a s e,P D)是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病,其特征性病理改变是黑质多巴胺(d o p a m i n e,D A)能神经元变性死亡㊂迄今为止,P D中黑质D A神经细胞死亡的原因尚不完全清楚,目前研究认为脑细胞线粒体损伤及其功能障碍是导致P D发病的机制之一[1-2]㊂腺苷酸活化蛋白激酶(AM P-a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e,AM P K)作为体内能量平衡的主要传感器,对于调控应激状态下机体的正常代谢至关重要,钙调蛋白激酶(C a2+/ c a l m o d u l i n-d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e k i n a s e2, C a MK Kβ)作为AM P K上游因子,可以通过其磷酸化来激活AM P K㊂C a MK Kβ/AM P K信号通路参与了细胞增殖㊁分化㊁凋亡㊁保护线粒体功能㊁对抗氧化应激等生理过程[3-4]㊂研究表明,C a MK Kβ/AM P K信号通路通过直接或间接调节各种与P D相关的蛋白,抑制神经细胞凋亡,在P D发病机制及神经元保护中发挥着重要作用[5]㊂此外,有证据显示,线粒体是C a MK Kβ/AM P K信号通路发挥神经保护作用的主要细胞器,AM P K通过直接或间接调节线粒体功能参与神经元的不同阶段调控[6-7]㊂
乌梅(F r u c t u s M u m e)为蔷薇科植物梅P r u n u s m u m e(S i e b.)S i e b.e t Z u c c.的干燥近成熟果实,为治疗P D的常用中药及配伍用药,乌梅总黄酮(F r u c t u s M u m e t o t a l f l a v o n e,F M F)为乌梅提取的有效成分,具有抗氧化㊁清除自由基㊁抗肿瘤㊁抗炎等药理作用[8]㊂本课题组前期研究发现,F M F具有保护P D模型大鼠神经元的作用,可以减轻6-羟基多巴(6-h y d r o x y d o p a m i n e,6-O H D A)引起的线粒体功能损伤[9],但是其作用机制尚不清楚㊂本实验拟通过神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-i n e t h y l-4-p h e n y l p y r i-d i n i u m,M P P+)诱导人神经母细胞瘤(S H-S Y5Y)细胞建立P D细胞模型,采用不同浓度的F M F干预,探讨F M F体外实验中的神经保护作用及相关机制,为临床应用乌梅和开发F M F新型防治P D提供科学依据㊂
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株
S H-S Y5Y细胞购自中国科学院细胞生物研究所,由广西中医药大学科学实验中心实验室保存传代㊂
1.1.2药品及试剂
纯度95%的F M F对照品(西安赛奥生物科技有限公司,批号:20210714)㊂D M E M培养基㊁胎牛血清(美国G i b c o公司);胰蛋白酶(美国S i g m a公司);线粒体膜电位(ΔΨm)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);B C A蛋白定量试剂盒(B C A P r o t e i n A s s a y K i t,美国C e l l S i g n a l i n g T e c h n o l o g y公司);
C C K-8试剂盒(美国A b c a m公司)㊂兔抗C a MK Kβ一抗㊁兔抗AM P K一抗㊁兔抗磷酸化C a MK Kβ(p-C a MK Kβ)一抗㊁兔抗磷酸化AM P K(p-AM P K)一抗(美国S a n t a C r u z公司);羊抗兔二抗(美国A b c a m 公司)㊂
1.1.3仪器
2891重庆医学2022年6月第51卷第12期
超净工作台(江苏省苏州空气净化设备公司);
C O2培养箱(日本三洋公司);I X51型倒置相差显微镜(日本O l y m p u s公司);低温离心机(美国T h e r m o F i s h e r S c i e n t i f i c公司);流式细胞仪(美国B e c k m a n 公司);全自动荧光酶标仪(美国T h e r m o F i s h e r S c i-
e n t i
f i c公司);蛋白电泳仪(美国B i o-R a d公司)㊂
1.2方法
1.2.1细胞培养
S H-S Y5Y细胞用D M E M培养基(含10%胎牛血清,100U/m L青霉素㊁100U/m L链霉素)培养,置于37ħ㊁饱和湿度㊁5%C O2培养箱中㊂隔天换液,每2~3天以1ʒ3传代,取对数生长期细胞进行实验㊂
1.2.2M P P+诱导S H-S Y5Y细胞模型的构建及分组
取对数生长期细胞,调整细胞悬液浓度1ˑ105/m L,接种于96孔板,细胞贴壁后,加入不同终浓度M P P+溶液(0㊁125㊁250㊁500㊁1000㊁2000μm o l/L),分别处理16㊁24㊁48h,C C K-8法检测细胞活性㊂以0μm o l/L M P P+为对照组,细胞活性及细胞数量明显下降,最终确定250μm o l/L终浓度的M P P+作用24h,建立P D的细胞模型㊂细胞实验分为5组:对照组(只加S H-S Y5Y细胞,不加药物)㊁模型组(250μm o l/L M P P+)㊁F M F低剂量组(250μm o l/L M P P++10μm o l/L F M F)㊁中剂量组(250μm o l/L M P P++50μm o l/L F M F)和高剂量组(250μm o l/L M P P++100μm o l/L F M F)㊂F M F各剂量组用不同终浓度的F M F(10㊁50㊁100μm o l/L)预处理24h后,然后再加入250μm o l/L终浓度的M P P+继续培养24h㊂
1.2.3 C C K-8法检测细胞存活率
细胞分组及处理同1.2.2㊂待细胞贴壁后,按照分组给予不同处理,至相应时间点,加入C C K-8工作液(每孔10μL),混匀,于37ħ培养箱中孵育3h,3h 后在全自动定量酶标仪上测定490n m处各孔吸光度(A490)值㊂实验重复3次取其均值㊂按以下公式计算细胞存活率:细胞存活率(%)=实验组A490值/对照组A490值ˑ100%㊂
1.2.4 ΔΨm检测
细胞分组及处理同1.2.2㊂各组细胞处理结束后,磷酸盐缓冲液(P B S)洗涤细胞2次,加入J C-1染色工作液,置于细胞培养箱中37ħ孵育20m i n,孵育结束后除去染色溶液,用J C-1染色缓冲液洗涤2次,胰蛋白酶消化收集细胞,然后用流式细胞仪检测细胞ΔΨm㊂1.2.5 W e s t e r n b l o t检测C a MK Kβ㊁AM P K表达及其磷酸化水平
细胞分组及处理同1.2.2㊂细胞培养24h后收集细胞,提取总蛋白,使用B C A蛋白定量试剂盒测定蛋白水平,取30μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)分离蛋白,并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(P V D F)上,5%脱脂奶粉室温下封闭2h,T B S T洗3次,每次5m i n,分别加入稀释好的一抗:C a MK Kβ(1ʒ500)㊁AM P K(1ʒ1000)㊁p-AM P K(1ʒ1000)㊁p-C a MK Kβ(1ʒ1000)一抗抗体和G A D P H抗体(内参,1ʒ2000)孵育,4ħ过夜T B S T洗3次,每次5m i n,加入辣根过氧化物酶标记与一抗同源的二抗I g G(1ʒ2000)室温50m i n,T B S T 洗3次,每次5m i n㊂将滤膜放入配好的显色液中反应1m i n,采用T a n o n软件拍摄图像并进行半定量分析㊂各组目的蛋白的相对表达水平=目的条带灰度值/内参条带灰度值㊂
1.3统计学处理
用S P S S22.0软件进行统计分析,计量资料以xʃs表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析(o n e-w a y A N O V A),以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1 F M F对S H-S Y5Y细胞存活率的影响
模型组S H-S Y5Y细胞存活率降低至(53.00ʃ6.16)%,与对照组(100%)比较,差异有统计学意义(P<0.001)㊂M P P+处理前分别给予不同浓度的F M F干预后,细胞存活率明显提高,F M F低㊁中㊁高剂量组细胞存活率分别为(62.67ʃ8.36)%㊁(72.00ʃ6.33)%㊁(86.67ʃ6.65)%,与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)㊂
2.2 F M F对M P P+诱导的S H-S Y5Y细胞ΔΨm的影响
与对照组[(20.54ʃ3.23)%]比较,模型组细胞ΔΨm[(1.92ʃ0.63)%]明显下降(P<0.001)㊂与模型组相比,F M F低㊁中㊁高剂量组细胞ΔΨm均上升,分别为(6.68ʃ0.83)%㊁(9.76ʃ1.92)%㊁(16.77ʃ3.47)%,差异有统计学意义(P<0.001),见图1㊂
2.3 F M F对M P P+诱导的S H-S Y5Y细胞C a M K Kβ㊁
A M P K表达及其磷酸化水平的影响
W e s t e r n b l o t检测结果显示,与对照组相比,模型组细胞p-C a MK Kβ㊁p-AM P K表达水平均明显降低(P<0.01)㊂与模型组比较,F M F低㊁中㊁高剂量组p-
C a MK Kβ表达水平均明显升高(P<0.01或P<
0.05),F M F低㊁中㊁高剂量均能上调p-AM P K表达
3891
重庆医学2022年6月第51卷第12期
(P <0.05或P <0.01)㊂经F M F 低㊁
中㊁高剂量处理后,细胞内的C a M K K β
㊁A M P K 表达水平与模型组细胞比较,差异均无统计学意义(P >0.05
),见表1㊁图2
㊂ A :对照组;B :模型组;C :F M F 高剂量组;D :F M F 中剂量组;E :F M F 低剂量组㊂
图1 流式细胞术检测F M F 对各组S H -S Y 5Y 细胞ΔΨm 的影响
表1 F M F 对P D 体外细胞模型中C a MK K β
㊁AM P K 表达及磷酸化水平的影响(n =5,x ʃs )组别p -C a MK K β/
G A D P H C a MK K β/
G A D P H p
-AM P K /G A D P H AM P K /G A D P H 对照组2.23ʃ0.240.75ʃ0.071.49ʃ0.170.52ʃ0.07模型组1.29ʃ0.12a 0.67ʃ0.050.51ʃ0.14a 0.47ʃ0.05F M F 低剂量组1.56ʃ0.13c 0.69ʃ0.040.74ʃ0.13c 0.49ʃ0.04F M F 中剂量组1.67ʃ0.20b 0.71ʃ0.061.07ʃ0.21b 0.51ʃ0.06F M F 高剂量组
1.95ʃ0.19
b
0.70ʃ0.05
0.84ʃ0.15
b
0.50ʃ0.05
a :P <0.01,与对照组比较;
b :P <0.01,c
:P <0.05,
与模型组比较
㊂ 1:对照组;2:模型组;3:F M F 低剂量组;4:F M F 中剂量组;5:F M F 高剂量组㊂
图2 W e s t e r n b l o t 检测F M F 对P D 体外细胞模型中
C a MK K β
㊁AM P K 表达及其磷酸化水平的影响3 讨 论
越来越多的研究表明,
线粒体功能损害及其引发的细胞氧化应激损伤在P D 的发病机制中起重要作
用[10-11]
㊂因此,将线粒体作为P D 治疗的靶点,
改善线粒体功能障碍,减轻线粒体氧化应激损伤,降低D A
能神经元死亡成为防治P D 的重要策略[12]
㊂
F M F 是从中药乌梅中提取的主要有效成分,具有抗氧化应激㊁抗衰老㊁抗炎㊁抗病毒等药理作用[13-14]
㊂本课题组研究发现,F M F 能下调B c l -2相关
X 蛋白(B a x )㊁半胱氨酸蛋白酶-3(c a s p
a s e -3)水平,升高B c l -2/B a x 比值,抑制M P P +
诱导的S H -S Y 5Y 细
胞凋亡㊂但是F M F 的神经保护作用是否与靶向线粒体㊁拮抗线粒体氧化应激损伤有关,以及其具体作用
机制,目前国内外还少有相关研究报道㊂M P P +
是一
种神经毒剂,通过神经细胞的多巴胺转运体(D A T )进入细胞后损伤线粒体功能,导致D A 能神经元损伤;
S H -S Y 5Y 细胞的生理功能㊁
细胞形态与正常的神经细胞相似,M P P +
诱导S H -S Y 5Y 细胞建立的P D 体外模型已得到国内外学者一致公认,并被广泛用于
P D 的实验研究
[15]
㊂因此,本研究采用M P P +
诱导损
4891重庆医学2022年6月第51卷第12期
伤S H-S Y5Y细胞建立P D的体外模型㊂
本研究采用M P P+处理S H-S Y5Y细胞,C C K-8法检测细胞的存活率,确定最佳建模浓度及时间为M P P+250μm o l/L处理24h,并用于研究F M F对P D体外细胞模型的保护作用及其可能的机制㊂结果表明,在M P P+刺激S H-S Y5Y细胞前24h,给予10㊁50㊁100μm o l/L F M F可抑制M P P+作用所产生的细胞存活率下降,且改变与药物呈剂量依赖关系,以100μm o l/L F M F保护作用最明显,提示在一定浓度范围内F M F对M P P+诱导损伤的S H-S Y5Y细胞具有保护作用㊂本课题组之前的研究也发现F M F对M P P+诱导的S H-S Y5Y细胞损伤具有明显的干预作用[16],因此该实验结果与以前的报道一致㊂
ΔΨm是稳定线粒体膜完整性,维持线粒体正常功能的关键因素[17]㊂当ΔΨm降低时,引起线粒体膜通透性改变,影响线粒体呼吸链,使体内氧自由基生成增加,进一步加重线粒体损伤,引起神经细胞功能障碍甚至死亡;此外,受损的线粒体释放细胞色素C (c y t o c h r o m e C,C y t C)和凋亡诱导因子,造成神经细胞凋亡[18]㊂本实验观察了F M F对S H-S Y5Y细胞线粒体功能的影响㊂J C-1染色是检测ΔΨm的常用方法[19]㊂J C-1检测结果显示,模型组细胞ΔΨm下降, F M F干预抑制了ΔΨm的下降,随着F M F浓度增加,ΔΨm逐渐上升,提示在一定浓度范围内F M F可部分恢复M P P+损伤S H-S Y5Y细胞的ΔΨm,具有保护线粒体膜功能的作用㊂
有研究表明,C a MK Kβ㊁AM P K是与P D发生㊁发展密切相关的蛋白[6,20]㊂A M P K是细胞重要的能量感受器和调节器,是能量代谢的关键调节因子[21]㊂有研究显示,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-m e t h y l-4-p h e n y l-1,2,3,6-t e t r a h y d r o p y r i d i n e,M P T P)诱导的P D 小鼠和M P P+处理的S H-S Y5Y细胞中,A M P K磷酸化受到抑制,应用A M P K的药理抑制剂C o m p o u n d C抑制A M P K的表达可增加M P P+诱导的细胞死亡[22-23]㊂AM P K受C a MK Kβ调节,C a MK Kβ是一种激活钙调素依赖蛋白激酶的激酶,是AM P K的主要上游蛋白激酶,可以激活AM P K,其作用位点是AM P Kα亚基T h r172[24]㊂有研究证实在M P T P诱导的P D小鼠模型脑黑质中C a MK Kβ表达明显下调[25]㊂近年研究显示,线粒体是C a MK Kβ/AM P K信号通路发挥神经保护作用的细胞靶器官,AM P K通过直接或间接调节线粒体功能参与神经元的不同阶段调控[26-27]㊂p-C a MK Kβ㊁p-AM P K是C a MK Kβ㊁AM P K的活化状态,是C a MK Kβ/AM P K信号通路活化的标志[28]㊂本研究中,M P P+明显降低S H-S Y5Y细胞C a MK Kβ㊁AM P K磷酸化水平,而F M F处理后可以明显提高C a MK Kβ㊁AM P K的磷酸化水平㊂基于这些结果,认为F M F可能通过激活C a MK Kβ/AM P K信号通路发挥对M P P+诱导的S H-S Y5Y细胞的神经保护作用㊂
综上所述,F M F可明显减轻M P P+诱导的S H-S Y5Y细胞损伤,抑制线粒体功能障碍㊂其潜在的作用机制可能是F M F能够调节C a MK Kβ/AM P K信号通路,缓解线粒体损伤,从而发挥神经保护作用㊂C a MK Kβ/AM P K信号通路可能成为治疗P D的有效靶点,而F M F如何启动C a MK Kβ/AM P K信号通路,需要通过进一步的实验完善研究㊂
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6891重庆医学2022年6月第51卷第12期。