补中益肾丸质量标准的研究

补中益肾丸质量标准的研究
目的:制定补中益肾丸质量控制方法。

方法:采用显微法鉴别茯苓,薄层色谱法鉴别丹参、黄芪、当归,采用饱和流出式固相萃取(SPE)法制备供试品溶液,高效液相色谱法测定其中芍药苷的含量,用ZorbaxSB C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以甲醇-乙腈-0.025%磷酸溶液(2∶13∶85)为流动相,流速为1 ml/min,检测波长为230 nm。

结果:定性鉴别方法简单专属,定性分析方法准确可靠,芍药苷的测定在
0.120～1.200 μg范围内线性关系良好,r=0.999 8,平均回收率为99.4%,RSD为
1.70%。

结论:所建立的标准可操作性强、质量可控。

标签：补中益肾丸;质量标准;鉴别;含量测定;芍药苷
[文献标识码]B
[文章编号]1674-4721(2009)08(a)-092-03
补中益肾丸(水丸)是根据临床验方,结合现代工艺研制的一种医院制剂。

主要由黄芪、当归、丹参、茯苓、赤芍等十五味中药组成。

具有活血化瘀、补气健脾之功效,适用于肾病综合征、慢性肾炎、慢性肝炎等体虚夹瘀,IgA肾病及肾虚腰痛症。

为控制制剂质量,保证药品疗效,受该院委托,我们建立了补中益肾丸的质量控制
标准[1]52,166。

1 仪器与试药
Olympus BX41 显微镜(日本);WFH-203三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);薄层色谱硅胶G预制板(20 cm×10 cm,上海东方药品科技实业有限公司); Lc-2010c高效液相色谱仪(日本);固相萃取小柱(自制);德国Sartorius BP 221S(万分之一)、BT 25S(十万分之一)电子天平;氧化铝(100～200目,上海五四化学试剂厂);丹参酮ⅡA对照品(批号:110766-200518),黄芪甲苷对照品(批号:110781-200613),当归对照药材(批号:120927-200613),芍药苷对照品(批号:110736-2004230),均来源于中国药品生物制品检定所;甲醇、乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。

补中益肾丸(水丸,批号:070711,070715,070718,由信阳市肾脏病医院提供)。

2 方法与结果
2.1定性鉴别
2.1.1 茯苓取本品,置显微镜下观察,不规则分枝状团块,无色,遇水合氯醛液渐溶化;菌丝无色或淡棕色,直径4～6 μm。

2.1.2 丹参取本品8 g,研细,置具塞锥形瓶中,加乙醚30 ml,超声处理15 min,在不通风环境下迅速滤过,滤液自然挥干,残渣加乙酸乙酯0.5 ml使溶解,作为供试品溶液。

再取丹参酮ⅡA对照品,加乙酸乙酯制成每1毫升含2 mg的溶液,作为对照品溶液。

照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VIB)试验,吸取供试品溶液15 μl、对照品溶液5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以苯-乙酸乙酯(19∶1)为展开剂,展开,取出,晾干。

供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的暗红色斑点,阴性样品无此斑点。

结果见图1。

2.1.3 黄芪取本品6 g,研细,加甲醇35 ml,加热回流1 h,滤过,滤液蒸干,残渣加水15 ml,微热使溶解,用水饱和的正丁醇提取两次,每次20 ml,合并正丁醇提取液,用氨试液洗涤2次,每次20 ml,再用水洗涤2次,每次20 ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇0.5 ml使溶解,作为供试品溶液。

另取黄芪甲苷对照品,加甲醇制成1 ml含1 mg的溶液,作为对照品溶液。

照薄层色谱法(附录VIB)试验,吸取供试品溶液10 μl、对照品溶液 5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶1)10 ℃以下放置2 h以上的下层溶液为展开剂,展至12～15 cm,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,置紫外灯(365 nm)下检视。

供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,阴性样品无此斑点[2]。

结果见图2。

2.1.4 当归取“2.2”项下的供试品溶液,挥去乙酸乙酯,残渣加丙酮0.5 ml作为供试品溶液。

取当归对照药材 1 g,同法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法(附录VIB)试验,吸取供试品溶液10 μl、对照药材溶液5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯(10∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外(365 nm)灯下检视。

供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显同颜色的荧光主斑点,阴性样品无此斑点。

结果见图3。

2.2 含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备精密称取五氧化二磷干燥至恒重的芍药苷对照12.51 mg,置25 ml容量瓶中,加甲醇溶解,并稀释至刻度为储备液。

精密移取储备液3 ml置25 ml容量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得质量浓度60.0 μg/ml 的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取大小适中的空心注射针筒,底部置一塞板,加入2.5 g中性氧化铝,即得自制的固相萃取小柱,加样前小柱用3倍柱体积的水预洗进行活化。

取补中益肾丸适量,研细,取约 2.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50 ml,密塞,放置2 h称定重量,超声提取(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,续滤液经上述小柱,流出速度控制在0.4～0.6 ml/min,收集第8～10毫升流出液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照液的制备按处方比例制备缺赤芍的补中益肾丸剂100 g,研细,取细粉2.5 g照“
3.2项下”制备即得阴性对照液。

2.2.4 色谱条件色谱柱,Agilent:ZorbaxSB C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相,甲醇-乙腈-0.025 mol/L (2∶13∶85);流速,1 ml/min;检测波长230 nm;柱温:室温。

进样量10 μl。

在上述色谱条件下,芍药苷的保留时间为12.58 min。

芍药苷与
其他组分可达到基线分离,阴性对照显示在芍药苷峰处无干扰。

见图4。

2.2.5 标准曲线的制备用自动进样器分别吸取对照品溶液2、4、5、10、15、20 μl进样,按上述色谱条件测定峰面积,以进样质量(μg)对峰面积(A)进行线性回归,求得回归方程:Y=72 824X+4 007,r=0.999 8,表明芍药苷在0.12～1.20 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl,连续进样6次,测得峰面积响应值的RSD=0.4%,表明系统精密度良好。

2.2.7 稳定性实验取同一批样品制得的供试品溶液,分别于0、2、4、6、8 h 各进样10 μl,记录色谱图,测得峰面积响应值的RSD=0.3%,可见供试品在8 h内稳定。

2.2.8 重复性实验同一批样品,平行精密称取6份,每份约2.5 g,按“
3.2方法”制备供试品溶液,然后分别进样10 μl,测得平均含量为1.258 8 mg/g,RSD=1.6%,表明该法重复性好。

2.2.9 加样回收率实验精密称取已知含量(1.258 8 mg/g)的样品细粉(批号070711)9份,分别置于具塞锥形瓶中,各精密加入对照品储备液(60 μg/ml)5 ml(3份)、6 ml(3份)、7ml(3份),按“
3.2项下方法”制备供试品溶液,进样测定[3]。

结果平均回收率为99.4%,RSD为1.70%。

2.2.10 样品含量测定取本品3批分别照“
3.2项下”处理,吸取样品溶液和对照品溶液各10 μl,注入液相色谱仪,测定,结果见表1。

3讨论
3.1 丹参、黄芪,当归的鉴别方法
均参照有关文献[1]52,89收载的薄层色谱条件,并在做大量实验的基础上,对薄层板、展开剂等进行了改进设计。

通过阴性对照及相应的对照品(对照药材)试验,结果显示斑点分离度较好,专属性较好。

其中黄芪薄层鉴别,样品杂质斑点较多,虽经过几种处理方法试图去除杂质,效果不是很明显,但按处方除去黄芪药味的阴性样品则不显斑点。

按处方除去当归的阴性样品在主斑点附近有一不同颜色的干扰点(样品和对照药材为蓝色荧光斑点,干扰点为黄色),展距增大至10 cm以上后能够降低干扰。

3.2 丸剂性状
本品按照中国药典2005年版一部附录制剂通则要求,应符合丸剂项下的水分、重量差异、溶散时限和微生物限度等有关规定和指标。

性状定为:本品为棕黄色至褐黄色的水丸;气微香,味微苦﹑涩而辛。

3.3 对于超声时间
我们分别做了不同时间(10、20、30、40 min)的助溶效果,结果为超声40 min 与30 min的得率无明显差异,故在该标准中定为30 min为超声时间[4]。

3.4 本品含量
根据赤芍饮片中芍药苷的含量限度[7]以及处方中赤芍的用量,拟定本品含量为每克含芍药苷不得少于1.20 mg。

[参考文献]
[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2005.
[2]李道明,周修森.SPE-HPLC法测定补中益气丸中芍药苷的含量[J].药学与临床研究,2008,16(1):71-73.
[3]李道明,徐道华.SPE-HPLC法测定二古肾气胶囊中芍药苷的含量[J].北方药学,2007,12,4(6):9.
[4]河南省食品药品监督管理局编.河南省中药饮片炮制规范[M].郑州:河南人民出版社,2005:29,117-118.。