一株感染家蚕的高致病性白僵菌的鉴定及在僵蚕生产中的应用
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广东省农业科学院院长基金项目（ No． 201434） 。 第一作者信息： 邢东旭（ 1983 － ） ，男，博士研究生。
Tel： 020-87237435，E-mail： dongxuxing@ 126． com 通信作者信息： 杨琼，研究员。
Tel： 020-87237435，E-mail： serilover@ 126． com * Corresponding author． E-mail： serilover@ 126． com
2014，40（ 5） ： 0879 － 0883 ISSN 0257 － 4799； CN 32 － 1115 / S E-mail： CYKE@ chinajournal． net． cn
Science of Sericulture
蚕业科学
一株感染家蚕的高致病性白僵菌的鉴定及在僵蚕生产中的应用
邢东旭 李 丽 廖 to silkworm （ Bombyx mori） would attribute to promotion of both output and quality of Bombyx batryticatus in large
scale production． A Beauveria bassiana strain with high pathogenicity to silkworm was isolated from the naturally infected
（ Sericulture ＆ Agri-food Ｒesearch Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510610，China）
Abstract Bombyx batryticatus is a traditional Chinese medicine． Screening for Beauveria bassiana strains with high patho-
silkworm body． Based on morphological observation and rＲNA ITS sequence phylogenetic analysis，this strain was identi-
fied as a species belonging to Beauveria bassiana and named as Beauveria bassiana JC-1． The optimized inoculation con-
centration of Beauveria bassiana JC-1 for Bombyx batryticatus production was 1 × 106 to 5 × 106 mL －1 ． At 5 to 6 d after the
spore suspension with this concentration was sprayed onto newly exuviated silkworm larvae of the 5th instar，the larvae
Bombyx batryticatus．
Key words Bombyx batryticatus； Beauveria bassiana；
收稿日期： 2014 － 05 － 21 接受日期： 2014 － 06 － 20 资助项目： 广东省教育部科技部产学研结合项目（ No． 2012B090600049） ，
died in large number，with petrification rate over 90% ． The output of Bombyx batryticatus was about 5 kg per 10 000 silk-
worm larvae． All quality indexes of the acquired Bombyx batryticatus met the relevant standards in Chinese Pharmacopoe-
关键词 僵蚕； 球孢白僵菌； 系统发育分析； 接种浓度； 僵化率
中图分类号 S884. 3 + 1； S886. 9
文献标识码 A
文章编号 0257 － 4799（ 2014） 05 － 0879 － 05
DOI:10.13441/ki.cykx.2014.05.018
Identification of a Beauveria bassiana Strain w ith High Pathogenici-
我们从不同蚕区收集自然感染白僵菌后的僵蚕， 经实验室分离纯化后获得 5 株白僵菌菌株。在同一 接种菌液浓度下各菌株对家蚕的毒力差异显著，家蚕 幼虫发病死亡率在 33% ～ 98% 之间，其中来自广东省 罗定蚕区的白僵菌菌株对家蚕的致病力最强。本项 研究利用形态学和分子生物学方法对该菌株进行鉴 定，优化该菌株在僵蚕生产中的接种菌液浓度，并对 接种该菌株生产僵蚕的药用品质进行评价。
（ 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广州 510610）
摘 要 僵蚕是传统中药材，筛选对家蚕具有高致病性的球孢白僵菌用于提高规模化生产僵蚕的产量和品质。从蚕区采集
的僵蚕虫体分离纯化到一株高致病力的白僵菌，通过形态学鉴定和 rＲNA ITS 序列系统发育分析，确定该菌株为球孢白僵菌 （ Beauveria bassiana） ，命名为 Beauveria bassiana JC-1。优化该菌株应用于僵蚕生产 中 的 接 种 菌 液 浓 度 为 1 × 106 ～ 5 × 106
ia． Moreover，total ashes content and acid-insoluble ash content were much lower in it than those in commercial Bombyx
batryticatus． Therefore，this strain is considered to have application value in standardized and large scale production of
mL －1 ，用此浓度的菌液喷洒接种 5 龄起蚕后 5 ～ 6 d，幼虫大量死亡，僵化率达 90% 以上，万头蚕可生产僵蚕约 5 kg。利用该菌
株感染家蚕收获所得僵蚕的各项质量指标均符合《中国药典》中的有关标准，且僵蚕的总灰分和酸不溶性灰分含量较市售僵
蚕更低。初步认为该菌株在僵蚕的标准化、规模化生产中具有应用价值。
880
蚕业科学
2014； 40 （ 5）
止痉、祛风止痛、化痰散结的功效［1］。据统计，现有的 513 种成药中有 49 种含白僵蚕，64 种儿科成药中含 白僵蚕的有 29 种，如七珍丸、太极升降丸、小儿奇应 丸、小儿镇惊丸等。最新资料表明，国内药品市场对 僵蚕的年需求量已达 2 500 ～ 3 000 t［2］。随着僵蚕在 医药、保健食品和化妆品等领域的广泛应用，预计其 需求还将逐年增加。
中药材市场上的僵蚕主要来源于个体商贩收 购的蚕农养蚕过程中的病死僵蚕。由于这些僵蚕 受致病菌株、家蚕品种和感染剂量以及感染僵化时 间的影响，其 药 用 品 质 参 差 不 齐。 而 且，在 晾 晒 或 收售僵蚕的 过 程 中，白 僵 菌 孢 子 粉 肆 意 扩 散，严 重 威胁到蚕 区 的 蚕 作 安 全［3］。 为 了 实 现 标 准 化 生 产 优质僵蚕以及严格控制病原白僵菌在蚕区传播的 目的，本课题组提出在非蚕区规模化人工生产僵蚕 的设想，但 由 于 缺 乏 优 良 的 白 僵 菌 菌 株，造 成 家 蚕 感染僵化率低，僵蚕的规模化生产未能达到预期的 效益［4］。因此，筛选对家蚕具有高致病力的球孢白 僵菌菌株是僵蚕产业化生产的重要基础条件。
用含 0. 2% 吐温-80 的灭菌水将供试白僵菌菌 株配制成浓度为 1 × 107 mL － 1 的孢子悬液，用接种针
将孢子悬液植于 PDA 平板培养基，每皿 1 点，重复 3 次。接种后置于 26 ℃ 恒温培养箱中培养，第 7 天观 察记录菌株菌落形态特征［5 － 6］，然后在光学显微镜 下观察该菌株的产孢结构和分生孢子形态。 1. 3 菌株的分子生物学鉴定 1. 3. 1 菌株的基因组 DNA 提取和 rＲNA ITS 序列 扩增 取 100 μL 供试白僵菌的孢子悬液（ 约 105 ～ 107 个孢子） ，参照 Universal Genome DNA Extraction Kit 试剂盒说明书提取基因组 DNA，利用通用引物 ITS4 （ 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和 ITS5 （ 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'） ［7］ 进 行 rＲNA ITS 的扩增。PCＲ 反应体系 25 μL，包括模板 DNA 1 μL、10 × PCＲ 缓冲液 2. 5 μL、dNTP 2 μL、5 U / μL Taq 酶 0. 2 μL、10 μmol / L 上下游引物各 1 μL 和 17. 5 μL 灭 菌 水。反 应 条 件 为： 94℃ 预 变 性 5 min； 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 30 次； 72 ℃ 延伸 10 min。 1. 3. 2 菌株 rＲNA ITS 序列的系统发育树构建 将 扩增 得 到 菌 株 rＲNA ITS 序 列 片 段 的 测 序 结 果 与 NCBI 数据库已登录中的白僵菌序列进行比对，下载 部分菌株序列用于系统发育分析。用 CLUSTAL X 软件进行序列比对分析； 用 MEGA 4. 0 软件的最大 似然法（ maximum likelihood，ML） 构建系统发育树， 选用蜡蚧轮枝菌（ Lecanicillium lecanii） ICAL-7 的同 源序列作为外群，进行 1 000 次重复。 1. 4 接种菌液浓度的优化
Phylogenetic analysis； Petrification rate
Inoculation concentration；
僵 蚕为家蚕（ Bombyx mori） 4 ～ 5 龄幼虫感染（ 或人 工接种） 球孢白僵菌［Beauveria bassiana （ Bals． ） Vuill． ］后致死的干燥体，是传统的中药材，具有息风
ty to Bom byx m ori and Its Application in Bom byx Batryticatus Pro-
d u c ti o n
XING Dong-Xu LI Li LIAO Sen-Tai XIAO Yang LI Qing-Ｒong YE Ming-Qiang YANG Qiong *
1 材料与方法
1. 1 材料和主要试剂 供试白僵菌菌株由本课题组采集自广东省罗
定蚕区自然感染白僵菌的家蚕，经实验室分离纯化 后所得。供试家蚕品种为两广二号，幼虫常规环境 条件下用桑叶饲育至 5 龄眠起供试。
对照市售僵蚕为渭南鑫星宇药业有限公司产 品（ 产地四川，批号 13070101） 。营养琼脂购于广东 环凯微生物科技有限公司，Universal Genomic DNA Extraction Kit 试剂盒和 DNA Marker 购自宝生物工 程（ 大连） 有限公司。 1. 2 菌株的形态学鉴定
用含 0. 2% 吐温-80 的无菌水将供试白僵菌菌 株分别配制成浓度为 1 × 107 、5 × 106 、1 × 106 、1 × 105 mL － 1 的孢子悬液，均匀喷洒 5 龄起蚕，以体表见 湿为宜。每个处理组 30 头蚕，分别设 3 个重复。试 验在 2013 年 5 月和 9 月各进行 1 次。蚕室温度控 制在 28 ℃ ± 2 ℃ ，相对湿度保持在 85% 以上。每天 调查统计接种不同浓度菌液试验组家蚕的死亡率。 调查统计后将僵蚕及时拣出，充分僵化后经 60 ℃ 烘 至恒重，比较各试验组僵蚕的单条质量。 1. 5 僵蚕的中试生产和质量检测
Tel： 020-87237435，E-mail： dongxuxing@ 126． com 通信作者信息： 杨琼，研究员。
Tel： 020-87237435，E-mail： serilover@ 126． com * Corresponding author． E-mail： serilover@ 126． com
2014，40（ 5） ： 0879 － 0883 ISSN 0257 － 4799； CN 32 － 1115 / S E-mail： CYKE@ chinajournal． net． cn
Science of Sericulture
蚕业科学
一株感染家蚕的高致病性白僵菌的鉴定及在僵蚕生产中的应用
邢东旭 李 丽 廖 to silkworm （ Bombyx mori） would attribute to promotion of both output and quality of Bombyx batryticatus in large
scale production． A Beauveria bassiana strain with high pathogenicity to silkworm was isolated from the naturally infected
（ Sericulture ＆ Agri-food Ｒesearch Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510610，China）
Abstract Bombyx batryticatus is a traditional Chinese medicine． Screening for Beauveria bassiana strains with high patho-
silkworm body． Based on morphological observation and rＲNA ITS sequence phylogenetic analysis，this strain was identi-
fied as a species belonging to Beauveria bassiana and named as Beauveria bassiana JC-1． The optimized inoculation con-
centration of Beauveria bassiana JC-1 for Bombyx batryticatus production was 1 × 106 to 5 × 106 mL －1 ． At 5 to 6 d after the
spore suspension with this concentration was sprayed onto newly exuviated silkworm larvae of the 5th instar，the larvae
Bombyx batryticatus．
Key words Bombyx batryticatus； Beauveria bassiana；
收稿日期： 2014 － 05 － 21 接受日期： 2014 － 06 － 20 资助项目： 广东省教育部科技部产学研结合项目（ No． 2012B090600049） ，
died in large number，with petrification rate over 90% ． The output of Bombyx batryticatus was about 5 kg per 10 000 silk-
worm larvae． All quality indexes of the acquired Bombyx batryticatus met the relevant standards in Chinese Pharmacopoe-
关键词 僵蚕； 球孢白僵菌； 系统发育分析； 接种浓度； 僵化率
中图分类号 S884. 3 + 1； S886. 9
文献标识码 A
文章编号 0257 － 4799（ 2014） 05 － 0879 － 05
DOI:10.13441/ki.cykx.2014.05.018
Identification of a Beauveria bassiana Strain w ith High Pathogenici-
我们从不同蚕区收集自然感染白僵菌后的僵蚕， 经实验室分离纯化后获得 5 株白僵菌菌株。在同一 接种菌液浓度下各菌株对家蚕的毒力差异显著，家蚕 幼虫发病死亡率在 33% ～ 98% 之间，其中来自广东省 罗定蚕区的白僵菌菌株对家蚕的致病力最强。本项 研究利用形态学和分子生物学方法对该菌株进行鉴 定，优化该菌株在僵蚕生产中的接种菌液浓度，并对 接种该菌株生产僵蚕的药用品质进行评价。
（ 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广州 510610）
摘 要 僵蚕是传统中药材，筛选对家蚕具有高致病性的球孢白僵菌用于提高规模化生产僵蚕的产量和品质。从蚕区采集
的僵蚕虫体分离纯化到一株高致病力的白僵菌，通过形态学鉴定和 rＲNA ITS 序列系统发育分析，确定该菌株为球孢白僵菌 （ Beauveria bassiana） ，命名为 Beauveria bassiana JC-1。优化该菌株应用于僵蚕生产 中 的 接 种 菌 液 浓 度 为 1 × 106 ～ 5 × 106
ia． Moreover，total ashes content and acid-insoluble ash content were much lower in it than those in commercial Bombyx
batryticatus． Therefore，this strain is considered to have application value in standardized and large scale production of
mL －1 ，用此浓度的菌液喷洒接种 5 龄起蚕后 5 ～ 6 d，幼虫大量死亡，僵化率达 90% 以上，万头蚕可生产僵蚕约 5 kg。利用该菌
株感染家蚕收获所得僵蚕的各项质量指标均符合《中国药典》中的有关标准，且僵蚕的总灰分和酸不溶性灰分含量较市售僵
蚕更低。初步认为该菌株在僵蚕的标准化、规模化生产中具有应用价值。
880
蚕业科学
2014； 40 （ 5）
止痉、祛风止痛、化痰散结的功效［1］。据统计，现有的 513 种成药中有 49 种含白僵蚕，64 种儿科成药中含 白僵蚕的有 29 种，如七珍丸、太极升降丸、小儿奇应 丸、小儿镇惊丸等。最新资料表明，国内药品市场对 僵蚕的年需求量已达 2 500 ～ 3 000 t［2］。随着僵蚕在 医药、保健食品和化妆品等领域的广泛应用，预计其 需求还将逐年增加。
中药材市场上的僵蚕主要来源于个体商贩收 购的蚕农养蚕过程中的病死僵蚕。由于这些僵蚕 受致病菌株、家蚕品种和感染剂量以及感染僵化时 间的影响，其 药 用 品 质 参 差 不 齐。 而 且，在 晾 晒 或 收售僵蚕的 过 程 中，白 僵 菌 孢 子 粉 肆 意 扩 散，严 重 威胁到蚕 区 的 蚕 作 安 全［3］。 为 了 实 现 标 准 化 生 产 优质僵蚕以及严格控制病原白僵菌在蚕区传播的 目的，本课题组提出在非蚕区规模化人工生产僵蚕 的设想，但 由 于 缺 乏 优 良 的 白 僵 菌 菌 株，造 成 家 蚕 感染僵化率低，僵蚕的规模化生产未能达到预期的 效益［4］。因此，筛选对家蚕具有高致病力的球孢白 僵菌菌株是僵蚕产业化生产的重要基础条件。
用含 0. 2% 吐温-80 的灭菌水将供试白僵菌菌 株配制成浓度为 1 × 107 mL － 1 的孢子悬液，用接种针
将孢子悬液植于 PDA 平板培养基，每皿 1 点，重复 3 次。接种后置于 26 ℃ 恒温培养箱中培养，第 7 天观 察记录菌株菌落形态特征［5 － 6］，然后在光学显微镜 下观察该菌株的产孢结构和分生孢子形态。 1. 3 菌株的分子生物学鉴定 1. 3. 1 菌株的基因组 DNA 提取和 rＲNA ITS 序列 扩增 取 100 μL 供试白僵菌的孢子悬液（ 约 105 ～ 107 个孢子） ，参照 Universal Genome DNA Extraction Kit 试剂盒说明书提取基因组 DNA，利用通用引物 ITS4 （ 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和 ITS5 （ 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'） ［7］ 进 行 rＲNA ITS 的扩增。PCＲ 反应体系 25 μL，包括模板 DNA 1 μL、10 × PCＲ 缓冲液 2. 5 μL、dNTP 2 μL、5 U / μL Taq 酶 0. 2 μL、10 μmol / L 上下游引物各 1 μL 和 17. 5 μL 灭 菌 水。反 应 条 件 为： 94℃ 预 变 性 5 min； 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环 30 次； 72 ℃ 延伸 10 min。 1. 3. 2 菌株 rＲNA ITS 序列的系统发育树构建 将 扩增 得 到 菌 株 rＲNA ITS 序 列 片 段 的 测 序 结 果 与 NCBI 数据库已登录中的白僵菌序列进行比对，下载 部分菌株序列用于系统发育分析。用 CLUSTAL X 软件进行序列比对分析； 用 MEGA 4. 0 软件的最大 似然法（ maximum likelihood，ML） 构建系统发育树， 选用蜡蚧轮枝菌（ Lecanicillium lecanii） ICAL-7 的同 源序列作为外群，进行 1 000 次重复。 1. 4 接种菌液浓度的优化
Phylogenetic analysis； Petrification rate
Inoculation concentration；
僵 蚕为家蚕（ Bombyx mori） 4 ～ 5 龄幼虫感染（ 或人 工接种） 球孢白僵菌［Beauveria bassiana （ Bals． ） Vuill． ］后致死的干燥体，是传统的中药材，具有息风
ty to Bom byx m ori and Its Application in Bom byx Batryticatus Pro-
d u c ti o n
XING Dong-Xu LI Li LIAO Sen-Tai XIAO Yang LI Qing-Ｒong YE Ming-Qiang YANG Qiong *
1 材料与方法
1. 1 材料和主要试剂 供试白僵菌菌株由本课题组采集自广东省罗
定蚕区自然感染白僵菌的家蚕，经实验室分离纯化 后所得。供试家蚕品种为两广二号，幼虫常规环境 条件下用桑叶饲育至 5 龄眠起供试。
对照市售僵蚕为渭南鑫星宇药业有限公司产 品（ 产地四川，批号 13070101） 。营养琼脂购于广东 环凯微生物科技有限公司，Universal Genomic DNA Extraction Kit 试剂盒和 DNA Marker 购自宝生物工 程（ 大连） 有限公司。 1. 2 菌株的形态学鉴定
用含 0. 2% 吐温-80 的无菌水将供试白僵菌菌 株分别配制成浓度为 1 × 107 、5 × 106 、1 × 106 、1 × 105 mL － 1 的孢子悬液，均匀喷洒 5 龄起蚕，以体表见 湿为宜。每个处理组 30 头蚕，分别设 3 个重复。试 验在 2013 年 5 月和 9 月各进行 1 次。蚕室温度控 制在 28 ℃ ± 2 ℃ ，相对湿度保持在 85% 以上。每天 调查统计接种不同浓度菌液试验组家蚕的死亡率。 调查统计后将僵蚕及时拣出，充分僵化后经 60 ℃ 烘 至恒重，比较各试验组僵蚕的单条质量。 1. 5 僵蚕的中试生产和质量检测