6.5 基因工程
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23
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
四 工具酶
1 限制性核酸内切酶 2 DNA 连接酶 3 碱性磷酸酶
25
1 限制性内切酶
限制性核酸内切酶( 限制性核酸内切酶(简称限制酶 Restriction Enzyme），是指能够识别双链DNA分子中特 ），是指能够识别双链 ），是指能够识别双链 分子中特 定的核苷酸序列，并对 定的核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的 分子进行切割的 一种内切酶。 一种内切酶。 发现于原核生物体内，是重组DNA技术和基因 发现于原核生物体内，是重组DNA技术和基因 DNA 诊断中重要的一类工具酶。 诊断中重要的一类工具酶。
第五节
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
DNA Recombination & Gene Engineering
2011-9-16
1
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
一 概述
1 基本概念 DNA重组 DNA重组 按照人的意愿，在体外将目的基因（ 按照人的意愿，在体外将目的基因（ DNA片段）与载体重组，然后将重组体转 DNA片段）与载体重组， 片段 移至另一细胞或生物体内，使其在细胞 至另一细胞或生物体内， 中扩增、繁殖和表达， 中扩增、繁殖和表达，以达到改良和创 造新的物种的目的。 造新的物种的目的。 物种的目的
适用于 克隆大 片段DNA 片段DNA 0.2～ ，0.2～ 2Mb。 2Mb。
YAC 的主要功能成份有三： 的主要功能成份有三：
着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减 姊妹染色单体和减I 1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同 源染色体分离之必需。 源染色体分离之必需。 端粒： 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵 袭。 自主复制序列（ARS）元件： 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自 主复制的复制起点。 主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列： 个端粒， YAC需要 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒 ARS元件 与外源DNA连接成线性DNA 元件， DNA连接成线性DNA分子 ，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子 导入酵母细胞克隆。 ，导入酵母细胞克隆。
1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划 中国获准加入人类基因组计划. 负责测定人类基因组全部序列的1% 负责测定人类基因组全部序列的 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作 草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
★5’端粘性末端（cohesive 端粘性末端（
end)
在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， DNA双链 于对称轴的5 末端切割。 于对称轴的5’末端切割。
★ 3’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， DNA双链 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， 于对称轴的3 末端切割。 于对称轴的3’末端切割。
1973 Cohen第一例成功的克隆实验 第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界 公司 上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物 重组人胰岛 第一个基因工程药物--重组人胰岛 素在英、 素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和 第一批转基因家畜（ 羊），中国转基因鱼 ），中国转基因鱼
27
1.2 限制性核酸内切酶的类型
限制性核酸内切酶分为3种类型： 限制性核酸内切酶分为3种类型：I型、II型和III型 II型和III型 型和III III型限制性核酸内切酶 （1）Ⅰ型和III型限制性核酸内切酶 ） 型和III Ⅰ型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。Ⅰ型 型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。 酶需要Mg ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因 酶需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因 子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿 切割方式也很奇特，它结合在识别位点， DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。 DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。 转位 III型酶与Ⅰ型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切 型酶与Ⅰ型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切 型酶与 III 割位点，在识别点的3’—端24～26bp处。 割位点，在识别点的 端 ～ 处
(2)II型酶 (2)II型酶
II型酶的识别 ① II型酶的识别 识别序列一般为4 个碱基对， 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重 复顺序，具有180 的旋转对称性。 180º的旋转对称性 复顺序，具有180 的旋转对称性。 II型酶的切割功能 ② II型酶的切割功能 平末端（ ★平末端（blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。 DNA同时切割 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。
26
1.1 限制性内切酶的命名
根据其来源命名。 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 来源于大肠杆菌E.coli 菌株 指在该菌株中分离的第一个限制酶。 指在该菌株中分离的第一个限制酶。
1.目的基因的制备 1.目的基因的制备
（1）人工合成：小分子蛋白质可根据一级结构推算 ）人工合成： DNA的序列直接合成。 的序列直接合成。 的序列直接合成 较大分子蛋白质根据一级结构推算DNA的序列，先分 的序列， 较大分子蛋白质根据一级结构推算 的序列 别合成片段，然后连接成一个大的片段。 别合成片段，然后连接成一个大的片段。 2）PCR扩增 扩增： （2）PCR扩增：对于已知全部或一部分序列的基因用 PCR法之间从染色体 法之间从染色体DNA或cDNA混合物中扩增出来。 混合物中扩增出来。 法之间从染色体 或 混合物中扩增出来 合成cDNA(complementary DNA,互 （3）通过 ）通过mRNA合成 合成 互 补DNA)：提纯 ：提纯mRNA，以特定 ，以特定mRNA为摸板反转录合 为摸板反转录合 成cDNA。 。
1.3 同切酶与同尾酶
（1）同切酶 来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割 ） 位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 如：HpaⅡ和MspⅠ，它们的识别序列均为 Ⅱ Ⅰ 它们的识别序列均为CCGG，切割位 ， 点均为C↓ 点均为 ↓CGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏 。 感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ MspⅠ均可对其切割， 感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ和MspⅠ均可对其切割， 如果胞嘧啶被修饰为5 甲基胞嘧啶， MspⅠ可以切割它， 如果胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶，则MspⅠ可以切割它， 而HpaⅡ就不能切割此序列。 HpaⅡ就不能切割此序列。
3
克隆（ 克隆（clone): 指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲 代完全相同的子代群体。 代完全相同的子代群体。 分子克隆（ cloning）： 分子克隆（molecular cloning）： 构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁 构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁 DNA 殖体系。 殖体系。
三、载体（vector） 载体（vector）
概念：将外源目的DNA DNA导入受体细 （一） 概念：将外源目的DNA导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。 并能自我复制和增殖的工具。
（二）载体的基本要求与特点
1.在宿主细胞内可独立复制 在宿主细胞内可独立复制 2.分子量尽可能小，以利分离纯化和离体操作 分子量尽可能小， 分子量尽可能小 3.有多种限制性内切酶的单一位点，切点内可插入外源DNA。 有多种限制性内切酶的单一位点，切点内可插入外源 。 有多种限制性内切酶的单一位点 4.有不影响其复制、生长的非必要区，此区域可插入、接受外源 有不影响其复制、生长的非必要区，此区域可插入、 有不影响其复制 DNA，并与载体分子一起复制、扩增。 ，并与载体分子一起复制、扩增。 5.有多种选择性标志：抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、 有多种选择性标志：抗药性基因：抗氨苄青霉素基因 有多种选择性标志 抗四环素基因(tet 、抗氯霉素基因（ ）、抗卡那霉素基 抗四环素基因 r)、抗氯霉素基因（Cmr）、抗卡那霉素基 因（Kanr）、抗新霉素基因（Neor）； ）、抗新霉素基因（ 抗新霉素基因 β-半乳糖苷酶基因 半乳糖苷酶基因(lac Z)
质粒plasmid 2.1 质粒plasmid
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能 自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
Plasmid Chromosome
常用的质粒如pUC19插入外源基因片段长度约10kb。 常用的质粒如pUC19插入外源基因片段长度约10kb。将外源 pUC19插入外源基因片段长度约10kb 基因插入到多克隆位点（MCS） 随质粒的表达而表达， 基因插入到多克隆位点（MCS）中，随质粒的表达而表达， 增殖而扩增。 增殖而扩增。
（4）染色体DNA的酶切： ）染色体 的酶制性 内切酶进行专一性水解，得到所需片段。 内切酶进行专一性水解，得到所需片段。
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
DNA重组技术的诞生 2 DNA重组技术的诞生
40年代明确了遗传的物质基础是 ① 40年代明确了遗传的物质基础是 DNA。 DNA。
50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模 年代揭示了DNA ② 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模 型和半保留复制
③ 关键是限制性内切酶的发现
3 基因工ห้องสมุดไป่ตู้大事记
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
二 目的基因
1. 目的基因 目的基因(target DNA)是指准备导入受 是指准备导入受 体细胞内的， 体细胞内的，以研究或应用为目的所需要 的外源基因。 的外源基因。
40年代明确了遗传的物质基础是dna肺炎链球菌50年代揭示了dna分子的双螺旋结构模型和半保留复制1973cohen第一例成功的克隆实验1978genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物重组人胰岛素在英美获准使用1985第一批转基因家畜兔猪和羊中国转基因鱼1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所19999中国获准加入人类基因组计划
EcoRI
HindIII
LacZ
pUC19
Ori复制起 Ori复制起 点 APR
19
大片段DNA DNA克隆载体 2.2 大片段DNA克隆载体
人类和哺乳动物的基因组很大， 人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（ 至许多单个基因也相当大（如：DMD 2300kb） gene 2300kb） ，克隆分析就需要 更大的基因载体。如近年来构建的 更大的基因载体。 一些载体：BAC，PI，YAC等 一些载体：BAC，PI，YAC等。
（三）载体分类
1.按照功能： 按照功能： 按照功能 克隆载体：含有松弛型复制子， 克隆载体：含有松弛型复制子，能在受体细胞种复 制和扩增。用于基因的复制、扩增、测序等； 制和扩增。用于基因的复制、扩增、测序等； 表达载体：用于目的基因的表达。 表达载体：用于目的基因的表达。 2.按载体本身的性质： 按载体本身的性质： 按载体本身的性质 质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC等
20
①细菌人工染色体（bacterial artificial 细菌人工染色体（ chromosome,BAC） chromosome,BAC）
特点： 特点：能携带 大片段DNA DNA， 大片段DNA， 300kb。 约300kb。
②酵母人工染色体（yeast artificial 酵母人工染色体（ YAC） chromosome, YAC）
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
四 工具酶
1 限制性核酸内切酶 2 DNA 连接酶 3 碱性磷酸酶
25
1 限制性内切酶
限制性核酸内切酶( 限制性核酸内切酶(简称限制酶 Restriction Enzyme），是指能够识别双链DNA分子中特 ），是指能够识别双链 ），是指能够识别双链 分子中特 定的核苷酸序列，并对 定的核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的 分子进行切割的 一种内切酶。 一种内切酶。 发现于原核生物体内，是重组DNA技术和基因 发现于原核生物体内，是重组DNA技术和基因 DNA 诊断中重要的一类工具酶。 诊断中重要的一类工具酶。
第五节
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
DNA Recombination & Gene Engineering
2011-9-16
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DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
一 概述
1 基本概念 DNA重组 DNA重组 按照人的意愿，在体外将目的基因（ 按照人的意愿，在体外将目的基因（ DNA片段）与载体重组，然后将重组体转 DNA片段）与载体重组， 片段 移至另一细胞或生物体内，使其在细胞 至另一细胞或生物体内， 中扩增、繁殖和表达， 中扩增、繁殖和表达，以达到改良和创 造新的物种的目的。 造新的物种的目的。 物种的目的
适用于 克隆大 片段DNA 片段DNA 0.2～ ，0.2～ 2Mb。 2Mb。
YAC 的主要功能成份有三： 的主要功能成份有三：
着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减 姊妹染色单体和减I 1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同 源染色体分离之必需。 源染色体分离之必需。 端粒： 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵 袭。 自主复制序列（ARS）元件： 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自 主复制的复制起点。 主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列： 个端粒， YAC需要 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒 ARS元件 与外源DNA连接成线性DNA 元件， DNA连接成线性DNA分子 ，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子 导入酵母细胞克隆。 ，导入酵母细胞克隆。
1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划 中国获准加入人类基因组计划. 负责测定人类基因组全部序列的1% 负责测定人类基因组全部序列的 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作 草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
★5’端粘性末端（cohesive 端粘性末端（
end)
在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， DNA双链 于对称轴的5 末端切割。 于对称轴的5’末端切割。
★ 3’端粘性末端 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， DNA双链 在识别顺序的双侧末端切割DNA双链， 于对称轴的3 末端切割。 于对称轴的3’末端切割。
1973 Cohen第一例成功的克隆实验 第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界 公司 上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物 重组人胰岛 第一个基因工程药物--重组人胰岛 素在英、 素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和 第一批转基因家畜（ 羊），中国转基因鱼 ），中国转基因鱼
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1.2 限制性核酸内切酶的类型
限制性核酸内切酶分为3种类型： 限制性核酸内切酶分为3种类型：I型、II型和III型 II型和III型 型和III III型限制性核酸内切酶 （1）Ⅰ型和III型限制性核酸内切酶 ） 型和III Ⅰ型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。Ⅰ型 型酶属复合功能酶，即兼具限制、修饰两种功能。 酶需要Mg ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因 酶需要Mg2+、ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸作为催化反应的辅因 子。切割方式也很奇特，它结合在识别位点，以滚环方式沿 切割方式也很奇特，它结合在识别位点， DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。 DNA转位，而后距其识别位点5侧数千个碱基处随机切割。 转位 III型酶与Ⅰ型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切 型酶与Ⅰ型酶基本相似，但是III型酶具有特异性的切 型酶与 III 割位点，在识别点的3’—端24～26bp处。 割位点，在识别点的 端 ～ 处
(2)II型酶 (2)II型酶
II型酶的识别 ① II型酶的识别 识别序列一般为4 个碱基对， 识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重 复顺序，具有180 的旋转对称性。 180º的旋转对称性 复顺序，具有180 的旋转对称性。 II型酶的切割功能 ② II型酶的切割功能 平末端（ ★平末端（blunt end) 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。 DNA同时切割 在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。
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1.1 限制性内切酶的命名
根据其来源命名。 根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I 来源于大肠杆菌E.coli 菌株 指在该菌株中分离的第一个限制酶。 指在该菌株中分离的第一个限制酶。
1.目的基因的制备 1.目的基因的制备
（1）人工合成：小分子蛋白质可根据一级结构推算 ）人工合成： DNA的序列直接合成。 的序列直接合成。 的序列直接合成 较大分子蛋白质根据一级结构推算DNA的序列，先分 的序列， 较大分子蛋白质根据一级结构推算 的序列 别合成片段，然后连接成一个大的片段。 别合成片段，然后连接成一个大的片段。 2）PCR扩增 扩增： （2）PCR扩增：对于已知全部或一部分序列的基因用 PCR法之间从染色体 法之间从染色体DNA或cDNA混合物中扩增出来。 混合物中扩增出来。 法之间从染色体 或 混合物中扩增出来 合成cDNA(complementary DNA,互 （3）通过 ）通过mRNA合成 合成 互 补DNA)：提纯 ：提纯mRNA，以特定 ，以特定mRNA为摸板反转录合 为摸板反转录合 成cDNA。 。
1.3 同切酶与同尾酶
（1）同切酶 来源不同但识别相同核苷酸序列并有相同切割 ） 位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 位点和形成同样的末端的限制性核酸内切酶称同裂酶。 如：HpaⅡ和MspⅠ，它们的识别序列均为 Ⅱ Ⅰ 它们的识别序列均为CCGG，切割位 ， 点均为C↓ 点均为 ↓CGG。有些同裂酶对切割位点是否与甲基化的敏 。 感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ MspⅠ均可对其切割， 感性不同。在不含有甲基时，HpaⅡ和MspⅠ均可对其切割， 如果胞嘧啶被修饰为5 甲基胞嘧啶， MspⅠ可以切割它， 如果胞嘧啶被修饰为5-甲基胞嘧啶，则MspⅠ可以切割它， 而HpaⅡ就不能切割此序列。 HpaⅡ就不能切割此序列。
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克隆（ 克隆（clone): 指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲 代完全相同的子代群体。 代完全相同的子代群体。 分子克隆（ cloning）： 分子克隆（molecular cloning）： 构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁 构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁 DNA 殖体系。 殖体系。
三、载体（vector） 载体（vector）
概念：将外源目的DNA DNA导入受体细 （一） 概念：将外源目的DNA导入受体细 胞，并能自我复制和增殖的工具。 并能自我复制和增殖的工具。
（二）载体的基本要求与特点
1.在宿主细胞内可独立复制 在宿主细胞内可独立复制 2.分子量尽可能小，以利分离纯化和离体操作 分子量尽可能小， 分子量尽可能小 3.有多种限制性内切酶的单一位点，切点内可插入外源DNA。 有多种限制性内切酶的单一位点，切点内可插入外源 。 有多种限制性内切酶的单一位点 4.有不影响其复制、生长的非必要区，此区域可插入、接受外源 有不影响其复制、生长的非必要区，此区域可插入、 有不影响其复制 DNA，并与载体分子一起复制、扩增。 ，并与载体分子一起复制、扩增。 5.有多种选择性标志：抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、 有多种选择性标志：抗药性基因：抗氨苄青霉素基因 有多种选择性标志 抗四环素基因(tet 、抗氯霉素基因（ ）、抗卡那霉素基 抗四环素基因 r)、抗氯霉素基因（Cmr）、抗卡那霉素基 因（Kanr）、抗新霉素基因（Neor）； ）、抗新霉素基因（ 抗新霉素基因 β-半乳糖苷酶基因 半乳糖苷酶基因(lac Z)
质粒plasmid 2.1 质粒plasmid
质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能 自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。
Plasmid Chromosome
常用的质粒如pUC19插入外源基因片段长度约10kb。 常用的质粒如pUC19插入外源基因片段长度约10kb。将外源 pUC19插入外源基因片段长度约10kb 基因插入到多克隆位点（MCS） 随质粒的表达而表达， 基因插入到多克隆位点（MCS）中，随质粒的表达而表达， 增殖而扩增。 增殖而扩增。
（4）染色体DNA的酶切： ）染色体 的酶制性 内切酶进行专一性水解，得到所需片段。 内切酶进行专一性水解，得到所需片段。
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
DNA重组技术的诞生 2 DNA重组技术的诞生
40年代明确了遗传的物质基础是 ① 40年代明确了遗传的物质基础是 DNA。 DNA。
50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模 年代揭示了DNA ② 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模 型和半保留复制
③ 关键是限制性内切酶的发现
3 基因工ห้องสมุดไป่ตู้大事记
DNA重组和基因工程 DNA重组和基因工程
一 二 三 四 五 六 七 概述 目的基因 载体 工具酶 基因重组 常用转基因方法 重组体的筛选
二 目的基因
1. 目的基因 目的基因(target DNA)是指准备导入受 是指准备导入受 体细胞内的， 体细胞内的，以研究或应用为目的所需要 的外源基因。 的外源基因。
40年代明确了遗传的物质基础是dna肺炎链球菌50年代揭示了dna分子的双螺旋结构模型和半保留复制1973cohen第一例成功的克隆实验1978genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物重组人胰岛素在英美获准使用1985第一批转基因家畜兔猪和羊中国转基因鱼1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所19999中国获准加入人类基因组计划
EcoRI
HindIII
LacZ
pUC19
Ori复制起 Ori复制起 点 APR
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大片段DNA DNA克隆载体 2.2 大片段DNA克隆载体
人类和哺乳动物的基因组很大， 人类和哺乳动物的基因组很大，甚 至许多单个基因也相当大（ 至许多单个基因也相当大（如：DMD 2300kb） gene 2300kb） ，克隆分析就需要 更大的基因载体。如近年来构建的 更大的基因载体。 一些载体：BAC，PI，YAC等 一些载体：BAC，PI，YAC等。
（三）载体分类
1.按照功能： 按照功能： 按照功能 克隆载体：含有松弛型复制子， 克隆载体：含有松弛型复制子，能在受体细胞种复 制和扩增。用于基因的复制、扩增、测序等； 制和扩增。用于基因的复制、扩增、测序等； 表达载体：用于目的基因的表达。 表达载体：用于目的基因的表达。 2.按载体本身的性质： 按载体本身的性质： 按载体本身的性质 质粒，λ噬菌体，粘粒，BAC，YAC等
20
①细菌人工染色体（bacterial artificial 细菌人工染色体（ chromosome,BAC） chromosome,BAC）
特点： 特点：能携带 大片段DNA DNA， 大片段DNA， 300kb。 约300kb。
②酵母人工染色体（yeast artificial 酵母人工染色体（ YAC） chromosome, YAC）