负染技术、扫描电镜样品制备技术
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
样品以液氮快速冷冻 移至真空 冰升华为汽 费时 低温损伤
3.坎烯干燥法
升华介质——坎烯 45oC以下为固态,室温中可升华
标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min
纯坎烯45oC 20min
室温,坎烯变为固体,
放入真空、升华
4.乙腈干燥法
标本预处理
50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min <用乙醇配制>
样品固定、脱水 中间液<醋酸异戊酯>置换
样品置入预冷的样品室 注入液态CO2
CO2置换 临界处理 放气取样
三 生物样品的导电 <一>目的
避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响 <二>方法
1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面<100-
200Å > 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率<≤100Å >； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
双蒸水洗涤30min, 2%单宁酸15min×2次,双蒸水洗涤30min 1%OsO4,4oC 30min, 双蒸水洗涤30min 梯度酒精脱水
二 生物样品的干燥 除去脱水剂使组织真正干燥,克服表面张力的影响,保 存样品表面微细结构 1.自然干燥法
无法避免表面张力的影响,仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法
负染技术 阴性反差染色,染色剂不被样品吸收而是沉淀到
样品四周.用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞成份 的检测.
〔一染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小
2-4%磷钨酸,； 2-3%醋酸铀,pH4.2
〔二操作方法 待检生物组织悬液滴于载网,静置5-10 min
2.冷冻割断的操作
TF-1冷冻割断仪
简易割断器
注入液氮
固化包埋
割断
溶化冲洗
3.标本制作法 取材<1×1×5mm>、前固定<1%OsO4,4oC 1h>浸洗<0.1M PBS,10min×3次 >
DMSO浸泡<12.5%、25%、50%各30min>
冷冻割断
后固定<0.1%OsO4,4oC 30min>
一 样品预处理 <一>常规样品
1.取材 5×8 mm, 保护观察面
2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗,快！
3.固定、脱水 同超薄切片
<二> 游离细胞 收集所需细胞
适量0.1%多聚赖氨酸
PBS洗涤,1000rpm 5min,弃上清
4×6 mm玻片,室温5-10min
滴入2-4ml 0.5%戊二醛,4oC 0.5h
吸去多余液体,成膜
PBS洗涤,1000 rpm 5min,弃上清,制成悬液 细胞悬液滴于玻片,5-30min滤纸吸去多余液体
膜未干
1%戊二醛,4oC 1h
PBS漂洗,1%OsO4,4oC 1h,梯度酒精脱水
〔三欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部
用"割断法"暴露观察部位
1.常用的割断法
二甲基亚砜<DMSO>割断法 环氧树脂割断法
2.离子溅射法/离子镀膜法
优点：①热辐射小 ②颗粒细、喷溅均匀 ③金属消耗少 3.导电染色法/组织导电技术<TOT>
利用金属盐<碘化甲、单宁酸>对生物体蛋白质、脂肪 的结合作用
扫描电镜生物样品制备的基本程序
知识回顾 Knowledge Review
用滤纸吸去载网边缘多余液体 载网未完全干
滴染色液,染色3-5min Nhomakorabea用滤纸吸去载网边缘多余液体,自然干燥,镜检 <三> 影响因素
1.被检样品纯度和浓度 2.染色液pH 3.操作技巧
扫描电镜生物样品制备技术 含水量少的组织<骨骼、牙齿、毛发等> 预处理、导电 含水量多的组织<大多数组织> 预处理、 干燥、 导电
立即置入真空,乙腈及样品冻结、升华
5.临界点干燥法 干燥效果最好,应用最广泛
⑴原理 物质三相<固、液、气>相互转化,可单相存在,也可 复相存在.
临界状态：物质在特定温度<临界温度>时,表面 张力系数为零,物质不以液态存在,变成气体.
液态CO2临界温度：31.5oC,临界压力72.8kg/cm2
⑵方法
3.坎烯干燥法
升华介质——坎烯 45oC以下为固态,室温中可升华
标本预处理 1:1环氧丙烷、坎烯混合液15min
纯坎烯45oC 20min
室温,坎烯变为固体,
放入真空、升华
4.乙腈干燥法
标本预处理
50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min <用乙醇配制>
样品固定、脱水 中间液<醋酸异戊酯>置换
样品置入预冷的样品室 注入液态CO2
CO2置换 临界处理 放气取样
三 生物样品的导电 <一>目的
避免因样品表面电荷的积累对二次电子成像的影响 <二>方法
1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面<100-
200Å > 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率<≤100Å >； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
双蒸水洗涤30min, 2%单宁酸15min×2次,双蒸水洗涤30min 1%OsO4,4oC 30min, 双蒸水洗涤30min 梯度酒精脱水
二 生物样品的干燥 除去脱水剂使组织真正干燥,克服表面张力的影响,保 存样品表面微细结构 1.自然干燥法
无法避免表面张力的影响,仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法
负染技术 阴性反差染色,染色剂不被样品吸收而是沉淀到
样品四周.用于细菌、病毒、噬菌体、亚细胞成份 的检测.
〔一染色液的特点 1.不和样品发生反应 2.可保护样品结构 3.可提供足够高的反差 4.本身颗粒体积很小
2-4%磷钨酸,； 2-3%醋酸铀,pH4.2
〔二操作方法 待检生物组织悬液滴于载网,静置5-10 min
2.冷冻割断的操作
TF-1冷冻割断仪
简易割断器
注入液氮
固化包埋
割断
溶化冲洗
3.标本制作法 取材<1×1×5mm>、前固定<1%OsO4,4oC 1h>浸洗<0.1M PBS,10min×3次 >
DMSO浸泡<12.5%、25%、50%各30min>
冷冻割断
后固定<0.1%OsO4,4oC 30min>
一 样品预处理 <一>常规样品
1.取材 5×8 mm, 保护观察面
2.清洗 漂洗、冲洗、擦洗,快！
3.固定、脱水 同超薄切片
<二> 游离细胞 收集所需细胞
适量0.1%多聚赖氨酸
PBS洗涤,1000rpm 5min,弃上清
4×6 mm玻片,室温5-10min
滴入2-4ml 0.5%戊二醛,4oC 0.5h
吸去多余液体,成膜
PBS洗涤,1000 rpm 5min,弃上清,制成悬液 细胞悬液滴于玻片,5-30min滤纸吸去多余液体
膜未干
1%戊二醛,4oC 1h
PBS漂洗,1%OsO4,4oC 1h,梯度酒精脱水
〔三欲看剖面的结构——实质性脏器的断面或细胞内部
用"割断法"暴露观察部位
1.常用的割断法
二甲基亚砜<DMSO>割断法 环氧树脂割断法
2.离子溅射法/离子镀膜法
优点：①热辐射小 ②颗粒细、喷溅均匀 ③金属消耗少 3.导电染色法/组织导电技术<TOT>
利用金属盐<碘化甲、单宁酸>对生物体蛋白质、脂肪 的结合作用
扫描电镜生物样品制备的基本程序
知识回顾 Knowledge Review
用滤纸吸去载网边缘多余液体 载网未完全干
滴染色液,染色3-5min Nhomakorabea用滤纸吸去载网边缘多余液体,自然干燥,镜检 <三> 影响因素
1.被检样品纯度和浓度 2.染色液pH 3.操作技巧
扫描电镜生物样品制备技术 含水量少的组织<骨骼、牙齿、毛发等> 预处理、导电 含水量多的组织<大多数组织> 预处理、 干燥、 导电
立即置入真空,乙腈及样品冻结、升华
5.临界点干燥法 干燥效果最好,应用最广泛
⑴原理 物质三相<固、液、气>相互转化,可单相存在,也可 复相存在.
临界状态：物质在特定温度<临界温度>时,表面 张力系数为零,物质不以液态存在,变成气体.
液态CO2临界温度：31.5oC,临界压力72.8kg/cm2
⑵方法