牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立

牛副流感病毒3型3种基因型多重RT-PCR检测方法的建立杨帆;石顺利;徐娜;雷宇;常塔娜;李平安;关平原
【摘要】为建立检测牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type
3,BPIV3)3种基因型的多重RT-PCR方法,根据GenBank上发表的BPIV3 3种基因型病毒株的HN基因序列设计特异性引物,优化反应体系建立多重RT-PCR方法.结果显示,方法可同时扩增出BPIV3 A型150 bp、B型253 bp和C型342 bp的特异性片段,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀性巴氏杆菌A型和B型均无交叉反应,A、B、C基因型BPIV3最低阳性质粒检测量分别为0.89×10 4、0.92×10 4和1.53×10 4拷贝/μL.本试验建立的多重RT-PCR检测方法操作方便、特异性强,应用于临床样本的检测,可快速检测BPIV3 3种基因型.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(045)001
【总页数】7页(P32-38)
【关键词】牛副流感病毒3型(BPIV3);基因型;多重RT-PCR;检测
【作者】杨帆;石顺利;徐娜;雷宇;常塔娜;李平安;关平原
【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古自治区通辽市家畜繁育指导站,通辽市028000;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业
部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018;内蒙古农业大学兽医学院,呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,呼和浩特010018
【正文语种】中文
【中图分类】S858.23
牛副流感又称“运输热”，是由牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)引起的，以呼吸道症状为主的疾病。

该病的发生常与应激因素的存在有关，通常与其他病毒细菌混合感染病畜，其病原是牛呼吸道疾病综合征的主要致病因素之一。

BPIV3是副黏病毒科(Paramyxoviridae)、呼吸道病毒属(Respirovirus)的单股负链RNA病毒，基因组由约15 000个核苷酸组成，至少编码6种结构蛋白[1]。

该病毒目前分为BPIV3 A、B和C 3个基因型。

BPIV3首先在美国被分离，之后陆续被世界上许多国家分离[2]。

在中国， 2001年童泽恩[3]对有呼吸道症状死牛剖检后首次发现疑似牛副流感。

2008年在中国牛群中第一次分离到BPIV3(NM09)[4]，随后由Wen等[5]鉴定为BPIV3基因A型。

Zhu等[6]分离并鉴定出BPIV3基因C型山东分离株(SD0835)。

中国目前没有分离到BPIV3基因B型。

到目前为止，国内外许多学者都建立了针对检测BPIV3的RT-PCR方法，但尚未见到有关BPIV3 3种基因型的RT-PCR检测方法的研究报道。

随着国内外对BPIV3的广泛研究，越来越多地区发现有BPIV3的流行，而近几年中国多个省份的血清学调查也显示BPIV3抗体阳性率较高，其中文献报道内蒙古血清阳性率分别达84.31%[7]和95.20%[8]。

鉴于内蒙古部分地区牛副流感血清学调查阳
性率高，但对其病原学调查尚不充分。

同时多重RT-PCR以其操作简便、快速的
优点常用于临床实践。

因此,本试验建立了BPIV3的3种基因型多重RT-PCR检测方法,并以此对内蒙古部分地区病料进行检测分析。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病毒和样品 BPIV3 A型RNA、牛病毒性腹泻病毒(BVDV) RNA和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)RNA均由内蒙古农业大学兽医学院兽医传染病学教研组惠赠；BPIV3 C型RNA、羊布鲁氏菌DNA(由羊布鲁氏菌Rev.1号疫苗中提取)、牛源多杀性巴氏杆菌A型DNA及牛源多杀性巴氏杆菌B型DNA均由金宇保灵生物药品有限公司惠赠；BPIV3 B型阳性克隆质粒pMD19-T-HNb由宝生物工程(大连)有
限公司合成。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛支原体RNA均由内蒙古农业大学兽医学院提供。

小反刍兽疫病毒(PPRV) RNA由新疆天康生物技术股份有限公司生产的疫苗中提取。

牛布鲁氏菌DNA从牛布鲁氏菌A19号疫苗中提取。

临床检测样品：牛肺脏样品12份，采自内蒙古自治区呼和浩特市某屠宰场；牛鼻拭子样品33份，采自内蒙古自治区呼和浩特市某牧场。

1.1.2 主要试剂及仪器病毒RNA/DNA 提取试剂盒、反转录试剂盒、Premix TaqTM、pMD19-T Vector、DL500 DNA Marker等均购自宝生物工程(大连)有限公司;KOD-Plus-购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；Amp、大肠杆菌DH5α
感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；AxyPrep质粒DNA提取试剂盒、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司;琼脂糖购自天根生化科技(北京)有限公司。

常规PCR仪购自Eppendorf Mastercycler公司；BG-Power 600i通用电泳仪购自北京百晶生物技术有限公司；Syngene G:BOX凝胶成像仪和Thermo ND2000微量分光光度计均购自Gene Company Limited公司。

1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成根据GenBank上发表的BPIV3 A型分离株NM09、B型分离株TVMDL15、C型分离株SD0835各自的HN基因序列，使用Oligo 6.0软件设计了特异性引物，引物信息见表1。

引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，-20 ℃保存备用。

1.2.2 核酸的提取及反转录样品及病毒的核酸均用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取。

其中样品及RNA病毒核酸利用RNA反转录试剂盒，通过在常规PCR仪中进行37 ℃ 15 min ，85 ℃ 5 s的反应合成cDNA。

以上DNA/cDNA经全自动酶标仪检测纯度符合要求，-20 ℃保存备用。

表1 引物信息
Table 1 Primers information
基因型Genotypes分离株IsolatesGenBank登录号GenBankaccessionNo.引物序列Primersequences(5'→3')产物长度
Productlength/bpBPIV3aNM09JQ063064F:GGGGGAAAACAAGAAGA150R:C TTTGTGTTGCCTTCTGGTTBPIV3bTVMDL15KJ647284R:AGATTATTAACAGCA TGATCG253F:TCAAAATTATGCGTTCTAABPIV3cSD0835HQ530153F:TGTAGC ACCAAACATCAAAGG342R:GCTTGCTGAATTTTTCTCTCG
1.2.3 单重RT-PCR方法反应条件的建立利用A型和C型BPIV3的cDNA、B型BPIV3阳性克隆质粒(pMD19-T-HNb)分别进行PCR反应，同时设定阴性对照(ddH2O)。

PCR反应体系25 μL：Premix TaqTM 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板1.0 μL，加ddH2O 至25 μL。

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，51(52、50) ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸8 min。

1.2.4 阳性克隆质粒的制备 BPIV3 A型和C型RNA PCR扩增后的目的片段连接
pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到重组菌，经PCR鉴定阳性的菌液送华大基因科技有限公司测序。

将测序结果与已知序列比对，并将相应的阳性重组质粒-20 ℃保存。

1.2.5 多重RT-PCR方法反应条件的建立在单重RT-PCR方法反应条件确定后，
优化出三重PCR方法反应条件建立多重RT-PCR方法。

优化出的引物比例为
4∶4∶2，反应采用单一模板和混合模板，同时设定阴性对照(ddH2O)。

PCR反应体系50 μL：KOD Plus 1 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus 5 μL，dNTP 5 μL，MgSO4 2 μL，上、下游混合引物(10 μmol/L)各1.5 μL(BPIV3a、BPIV3b、BPIV3c的引物按4∶4∶2混合)，模板3.0 μL，加ddH2O至50 μL。

PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，51.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，
共35个循环；72 ℃延伸8 min。

PCR反应产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在凝胶成像系统下观察并记录结果。

1.2.6 敏感性试验以BPIV3 3种阳性克隆质粒pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb 和pMD19-T-HNc混合后为模板，并依次进行10倍系列梯度稀释，参考1.2.5方法进行RT-PCR反应。

PCR反应产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，在凝胶成像系统下观察并记录结果。

1.2.7 特异性试验将BPIV3 3种阳性克隆质粒pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb 和pMD19-T-HNc混合后作为标准阳性对照模板，同时设定阴性对照(ddH2O)。

IBRV、BRSV、BVDV、PPRV的RNA及牛支原体、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型的DNA均作为特异性试验的其他模板。

参考1.2.5方法进行RT-PCR反应。

PCR反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,凝胶成像
系统下检测反应结果。

1.2.8 重复性试验分别以pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa+pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNb+pMD19-T-HNc、
pMD19-T-HNa+pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa+pMD19-T-HNb+pMD19-T-HNc为模板，其中混合模板的组分均为等浓度混合，同时设定阴性对照
(ddH2O)。

每类模板进行3个重复，参考1.2.5方法进行RT-PCR反应。

PCR产
物经2.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并于凝胶成像系统下观察结果。

1.2.9 多重RT-PCR方法检测临床样品将采集的12份牛肺脏样品加液氮研磨成粉末状并加PBS混匀，将采集的33份鼻拭子样品加PBS洗脱，然后均用
DNA/RNA提取试剂盒提取核酸，参考1.2.5方法进行检测。

2 结果
2.1 单重RT-PCR扩增结果
以BPIV3的A型和C型的cDNA、pMD19-T-HNb为模板分别进行PCR反应，以ddH2O为阴性对照，结果发现，扩增的目的片段长度与预期一致，分别为150、342、253 bp(图1)。

随后进行C型BPIV3目的片段的胶回收。

M，DL500 DNA Marker；1，阴性对照；2，BPIV3c；3，BPIV3b；4，
BPIV3aM，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2，BPIV3c；3，BPIV3b；4，BPIV3a图1 BPIV3 3种基因型单重PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification for three genotypes of BPIV3
2.2 重组阳性克隆质粒的鉴定
将含有BPIV3a、BPIV3b、BPIV3c目的片段的阳性重组菌液送华大基因科技股份(北京)有限公司进行测序，测序结果与GenBank上的原始序列进行比对,同源性分别为100.0%、100.0%和99.4%。

2.3 多重RT-PCR扩增目的片段
以pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc、pMD19-T-
HNa+pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNb+pMD19-T-HNc、pMD19-T-
HNa+pMD19-T-HNc、pMD19-T-HNa+pMD19-T-HNb+pMD19-T-HNc分
别为模板，以ddH2O为阴性对照,进行多重RT-PCR反应，随后用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

在凝胶成像系统下观察扩增目的片段数目和长度与预期一致，为150、253、342、150/253、253/342、150/342、150/253/342 bp(图2)。

2.4 敏感性试验结果
以pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc的标准阳性混合模板作梯度稀释后(8个稀释度)进行多重RT-PCR反应。

结果显示，对pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb、pMD19-T-HNc的最低阳性质粒检测量为0.89×104、
0.92×104和1.53×104拷贝/μL(图3)。

2.5 特异性试验结果
在pMD19-T-HNa、pMD19-T-HNb和pMD19-T-HNc的标准阳性混合模板，
与其他核酸模板同时进行多重RT-PCR反应，发现除标准阳性模板扩增出
150/253/342 bp的条带之外，其余(包括阴性对照)均未出现条带(图4)，表明本
方法特异性高。

M，DL500 DNA Marker；1，阴性对照；2，BPIV3c；3，BPIV3b；4，BPIV3a；5，BPIV3b+BPIV3c；6，BPIV3a+BPIV3c；7，BPIV3a+BPIV3b；8，
BPIV3a+BPIV3b+BPIV3c M，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2，BPIV3c；3，BPIV3b；4，BPIV3a；5，BPIV3b+BPIV3c；6，BPIV3a+BPIV3c；7，BPIV3a+BPIV3b；8，BPIV3a+BPIV3b+BPIV3c图2 BPIV3 3种基因型阳性克隆质粒多重RT-PCR结果Fig.2 Multiplex RT-PCR amplification for three genotypes of BPIV3
M，DL500 DNA Marker；1，阴性对照；2～9，pMD19-T-HNa 0.89×1010至0.89×103拷贝/μL(pMD19-T-HNb 0.92×1010至0.92×103拷贝/μL,pMD19-
T-HNc 1.53×1010至1.53×103拷贝/μL)M，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2-9，pMD19-T-HNa，0.89×1010to 0.89×103
copies/μL(pMD19-T-HNb，0.92×1010 to 0.92×103 copies/μL,pMD19-T-HNc，1.53×1010 to 1.53×103 copies/μL)图3 多重RT-PCR方法灵敏性试验结果Fig.3 Sensitivity test result of the multiplex RT-PCR assay
2.6 重复性试验结果
单一模板和混合模板共7种模板，每种模板重复3次，在RT-PCR反应后的电泳
结果显示每类模板的3个重复中目的片段均一致，阴性对照未出现条带(图5)。

这表明本方法的可重复性高，检测结果稳定。

M，DL500 DNA Marker；1，阴性对照；2，阳性对照；3，IBRV；4，BRSV；5，BVDV；6，牛支原体；7，PPRV；8，羊布鲁氏菌；9，牛布鲁氏菌；10，牛
源多杀性巴氏杆菌A型；11，牛源多杀性巴氏杆菌B型M，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2，Positive control；3，IBRV；4，BRSV；5，BVDV；6，M.bovis；7，PPRV；8，B.melitensis；9，B.abortus；10，Bovine P.multocida serotype A；11，Bovine P.multocida serotype B图4 多重RT-PCR方法特异性试验结果Fig.4 Specificity test result of multiplex RT-PCR assay
M，DL500 DNA Marker；1～3，BPIV3a；4～6，BPIV3c；7～9，BPIV3b；10～12，BPIV3a+BPIV3b；13～15，BPIV3b+BPIV3c；16～18，
BPIV3a+BPIV3c；19～21，BPIV3a+BPIV3b+BPIV3c；22，阴性对照M，
DL500 DNA Marker；1-3，BPIV3a；4-6，BPIV3c；7-9，BPIV3b；10-12，BPIV3a+BPIV3b；13-15，BPIV3b+BPIV3c；16-18，BPIV3a+BPIV3c；19-21，BPIV3a+BPIV3b+BPIV3c；22，Negative control图5 多重RT-PCR方法重复
性试验结果Fig.5 Repeatability test result of multiplex RT-PCR assay
2.7 多重RT-PCR方法对部分临床样品的检测结果
应用本方法检测临床33份牛鼻拭子样品和11份牛肺脏样品，结果均为阴性。

部
分样品检测结果见图6。

M，DL500 DNA Marker；1，阴性对照；2，阳性对照；3～9，牛鼻拭子样品；10～13，牛肺脏样品M，DL500 DNA Marker；1，Negative control；2，Positive control；3-9，Bovine nasal swab samples；10-13，Bovine lung samples图6 多重RT-PCR方法对部分临床样品的检测结果Fig.6 Results of multiplex RT-PCR detection for some clinical samples
3 讨论
牛副流感的病原为BPIV3，该病常发生于秋冬两季，病毒通常感染高密度舍饲或
长途运输的牛群，引起急性的呼吸道症状如咳嗽和流鼻液，同时继发感染其他细菌病毒,如多杀性巴氏杆菌和IBRV，导致病牛产生严重的呼吸系统症状甚至导致全身败血症[9]。

同时该病毒多与BRSV和BVDV等病毒混合感染引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)[10]，可能会引起病牛大量死亡，造成养殖业巨大的经济损失。

目前，BPIV3在世界许多国家均有研究报道，而近几年中国多个省份的血清学调查也显
现出BPIV3的流行。

目前，国内外许多学者都建立了针对BPIV3的RT-PCR方法。

研究多为单独检测BPIV3的RT-PCR方法或可同时检测两种及两种以上病原的多重RT-PCR方法。

师新川等[11]在2012年针对BPIV3建立RT-LAMP检测方法;Horwood等[12]在2013年建立针对BVDV、IBRV、BPIV3多重实时荧光定量RT-PCR方法；郭利等[13]于2014年建立了在同一体系内同时检测IBRV、BRSV、BVDV、BPIV3 4种
病毒的多重PCR方法；闻晓波等[14]在2017年建立了BPIV3的SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR方法。

但到目前为止，并没有针对区分BPIV3的3种基因型的RT-PCR方法的报道，有报道显示BPIV3的3种基因型序列的差异性仅在2%～18%之间[15]，国内外研究多以HN和M基因作为分型基因，而其中以HN基因作为常见的分型候选基因[16]，试验通过HN基因序列比对设计合适引物，筛选引
物配比和退火温度优化体系建立多重RT-PCR方法，可同时扩增出BPIV3的3种
基因型长度分别为150、253和342 bp的特异性目的片段。

本研究建立的可检测BPIV3 3种基因型的RT-PCR方法对BPIV3的准确分型和分离中国未出现的
BPIV3b具有一定参考价值。

中国目前仅分离到A型和C型的BPIV3，且这两类基因型临床分离毒株相对较少，尚未见分离到B型的BPIV3[17-18]，美国和澳大利亚已存在B型BPIV3的流行，而随着近几年从国外进口种牛数量增加，可能存在尚未发现的B型BPIV3病毒传
入中国，因此,建立BPIV3分型RT-PCR方法对此病的病原基因型调查具有实际意义。

虽然目前没有数据提到不同基因型病毒对牛的致病性有差异，但2015年
Neill等[19]通过研究美国分离的3个基因型共6株BPIV3发现不同基因型之间存在抗原差异，国外更有进一步的疫苗和动物试验研究报道表明这种抗原差异性的存在[20-21]。

因此，建立BPIV3 3种基因型多重RT-PCR的检测方法可针对该病进行病毒分子流行病学的研究，经病毒核苷酸序列数据比对分析牛副流感流行情况，为预防和控制牛副流感提供数据和技术支持，更有助于后续针对性疫苗的研制。

4 结论
本试验建立的检测鉴别BPIV3的3种基因型的多重RT-PCR方法操作简单，特异
性和稳定性好，灵敏性较高，可同时扩增出BPIV3的A、B、C 3种基因型长度分别为150、253和342 bp的特异性目的片段，在BPIV3的检测中具有应用价值。

参考文献(References)：
[1] 董秀梅.牛副流感病毒3型山东分离株致病性研究及荧光定量RT-PCR的建立
[D].北京：中国农业科学院,2012.
DONG X M. Studies on the pathogenesis of Shandong strain of bovine parainfluenza virus type 3 and development of a Real-time fluorescent quantitative RT-PCR[D].Beijing: Chinese Academy of Agricultural
Sciences,2012. (in Chinese)
[2] ELLIS J A. Bovine parainfluenza-3 virus[J]. Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice,2010,26(3):575-593.
[3] 童泽恩.一起疑似牛副流感的诊断和治疗报告[J].中国动物检疫,2002,19(8):40. TONG Z E. A report on the diagnosis and treatment of suspected bovine parainfluenza[J].Chinese Journal of Animal Quarantine,2002,19(8):40. (in Chinese)
[4] 刘鹏,侯喜林,周玉龙,等.牛副流感病毒3型的分离鉴定[J].微生物学通
报,2009,36(9):1384-1389.
LIU P, HOU X L, ZHOU Y L, et al.Isolation and identification of bovine parainfluenza virus type 3[J].Microbiology,2009,36(9):1384-1389. (in Chinese)
[5] WEN Y J,SHI X C,WANG F X,et al.Phylogenetic analysis of the bovine parainfluenza virus type 3 from cattle herds revealing the existence of a genotype A strain in China[J].Virus Genes,2012,45(3):542-547.
[6] ZHU Y M, SHI H F,GAO Y R,et al.Isolation and genetic characterization of bovine parainfluenza virus type 3 from cattle in China[J].Veterinary Microbiology,2011,149(3-4):446-451.
[7] 霍志云,童钦,胡嘉欣,等.北方三省(区)牛副流感病毒3型的血清学调查[J].动物医学进展,2012,33(9):124-126.
HUO Z Y,TONG Q,HU J X,et al.The serological investigation of bovine parainfluenza virus type 3 in three Northern provinces[J].Progress in Veterinary Medicine,2012,33(9):124-126. (in Chinese)
[8] 张欣欣,王业华,乌力吉那仁,等.内蒙古地区部分奶牛场牛副流感血清学调查[J].畜
牧与饲料科学,2016, 37(2):17-18．
ZHANG X X,WANG Y H, Wulijinaren,et al.A serological epidemiology survey of antibodies against bovine parainfluenza virus type 3 in dairy farms of Inner Mongolia[J].Animal Husbandry and Feed Science,2016,37(2):17-18． (in Chinese)
[9] 冉旭华,张峣,闻晓波.牛副流感病毒3型研究概述[J].黑龙江八一农垦大学学报,2017,29(3):24-28.
RAN X H,ZHANG X,WEN X B. Review of bovine parainfluenza virus type
3[J].Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University,2017,29(3):24-28. (in Chinese)
[10] NG T F F,KONDOV N O,DENG X T,et al.A Metagenomics and case-control study to identify viruses associated with bovine respiratory disease[J].Journal of Virol,2015,89(10):5340-5349.
[11] 师新川,温永俊,王凤雪,等.牛副流感病毒3型RT-LAMP 检测方法的建立及应用[J].中国畜牧兽医,2012,39(11):31-34.
SHI X C,WEN Y J,WANG F X,et al. Establishment and application of RT-LAMP detection method for bovine parainfluenza virus type 3[J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2012,39(11):31-34. (in Chinese) [12] HORWOOD P F,MAHONY T J.Multiplex Real-time RT-PCR detection of three viruses associated with the bovine respiratory disease
complex[J].Journal of Virological Methods,2011,171(2):360-363.
[13] 郭利,王炜,张淑琴,等.牛呼吸道疾病综合征相关病毒BVDV、BPIV3、IBRV和BRSV多重PCR检测方法的建立[J]. 特产研究,2014,1:12-16.
GUO L,WANG W,ZHANG S Q,et al.A multiplex PCR to detect the viruses of
BVDV, BPIV3, IBRV and BRSV associated with the bovine respiratory disease complex in clinical[J].Special Wild Economic Animal and Plant Research,2014,1:12-16. (in Chinese)
[14] 闻晓波,张玲玲,张峣,等. 牛副流感病毒3型SYBR GreenⅠQ-PCR方法的建立[J].现代畜牧兽医,2017,5:8-14.
WEN X B,ZHANG L L,ZHANG X,et al.SYBR Green Ⅰ Q-PCR assay for detection of bovine parainfluenza virus type 3[J].Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2017,5:8-14. (in Chinese)
[15] YANG L L, LEI W L,MAO L,et al.Analysis on the complete genome of a novel caprine parainfluenza virus 3[J].Infection, Genetics and Evolution, 2016,38:29-34.
[16] VAUCHER R D, SIMONETTI A B,ROEHE P M. RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3(bPIV-3)[J].Acta Scientiae Veterinariae,2008,36(3):215-220.
[17] 冉旭华,张峣,曹思,等. C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定[J]. 中国畜牧兽医,2016,43(5):1368-1373.
RAN X H,ZHANG Y,CAO S,et al.Isolation and identification of BPIV3 genotype C[J].China Animal Husbandry & Veterinary
Medicine,2016,43(5):1368-1373. (in Chinese)
[18] WEN X B,SUN J H,ZHANG Y,et al.Identification and genetic characterization of bovine parainfluenza virus type 3 genotype C strain isolated from cattle in Western China[J].Turkish Journal of Veterinary & Animal Science,2017,41(2):180-186.
[19] NEILL J D,RIDPATH J F,VALAYUDHAN B T.Identification and genome
characterization of genotype B and genotype C bovine parainfluenza type 3 viruses isolated in the United States[J].BMC Veterinary
Research,2015,11:112.
[20] NEWCOMER B W, NEILL J D, GALIK P K,et al.Serologic survey for antibodies against three genotypes of bovine parainfluenza 3 virus in unvaccinated ungulates in Alabama[J].American Journal of Veterinary Research,2017,78(2):239-243.
[21] FULTON R W, NEILL J D, SALIKI J T,et al.Genomic and antigenic characterization of bovine parainfluenza-3 viruses in the United States including modified live virus vaccine (MLV) strains and field strains from cattle[J].Virus Research,2017,235:77-81.。