Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的抑制作用

Genistein对人乳腺癌细胞体外侵袭能力的
抑制作用
焦敏南克俊雷燕张茜孙海凤
【摘要】目的：研究金雀异黄素(genistein)对人乳腺癌细胞株MDA MB231体外侵袭能力的阻碍并探讨其机制.方式：采纳细胞体外侵袭实验系统，观看genistein对乳腺癌细胞体外侵袭能力的阻碍；应用WesternBlot检测药物作用后MMP2,MMP9蛋白表达的转变，采纳明胶酶谱分析法对药物作用前后乳腺癌细胞分泌的MMP
2,MMP9活性进行分析.结果：在药物作用24，48，72h后，15μmol/L 组和30μmol/L组侵袭至Matrilgel滤膜下的细胞数别离为（245±12）个，（300±20）个，（378±18）个和（155±20）个，（204±30）个，（256±34）个，较空白对照组显著减少(P<.WesternBlot结果显示，在药物作用48h后，0，15，30μmol/L组的MMP2蛋白相对值别离为±，±和±；MMP9的相对值别离为±，±和±.明胶酶谱分析结果显示，15，30μmol/L组基质金属蛋白酶活性显著降低(P<.结论：genistein有效抑制乳腺癌侵袭和转移，其作用机制可能与降低乳腺癌细胞运动能力，抑制MMP2，MMP9表达水平与活性有关.
【关键词】乳腺肿瘤；染料木黄酮；侵袭；基质金属蛋白酶类
0引言
MB231细胞株为研究对象，观看genistein对其侵袭转移的作用并探讨可能的分子机制，为genistein应用于肿瘤临床医治提供
实验依据.
1材料和方式
材料雌激素受体阴性乳腺癌细胞株MDA MB231(美国模式菌种搜集中心ATCC细胞库)；genistein，明胶（美国Sigma公司）；鼠抗人MMP2，MMP9mAb（北京中山生物工程公司）；DMEM培育基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料）；Q550IW图像分析仪(德国LEICA公司).
方式
体外细胞侵袭实验在24孔培育板中放入Transwell小室(装有聚碳酸酯微孔滤膜，孔径8μm)，将基质胶用无血清DMEM培育液按1∶20稀释后，取100μμ×103个MDA MB231细胞的悬液接种于上室，加入药物genitein使其终浓度别离为0，15，30μmol/L，37℃孵育24，48，72h后，掏出Transwell小室，L，淋洗，棉签擦拭微孔膜上层，将已经侵入并贴附于微孔膜基层的细胞固定于20g/L多聚甲醛中30min，Giemsa染色后进行细胞计数.
检测乳腺癌细胞株MDA MB231传代于100mm的培育皿中，待细胞贴壁后，别离加入浓度为0，15，30μmol/L的genistein，作用48h后，别离提取细胞总蛋白分析.细胞用冷PBS洗涤2次，用300μLRapa裂解液裂解细胞，细胞裂解物-80℃留宿，然后刮取细胞，以12000g，4℃离心15min，搜集上清移入新的离心管中，考马斯亮兰法定量样本蛋白浓度.依据测定蛋白浓度，取20μg总蛋白进行100g/LSDS PAGE胶电泳，然后电转移至NC膜上.用含有50g/L去脂
奶粉的TBST(TBS+1g/L吐温-20)封锁；别离加入一抗MMP2，MMP 9mAb(各按1∶250稀释)，孵育2h，TBST漂洗30min；HRPβactin蛋白为内参照.WesternBlot结果用Bandscan扫描软件进行灰度测定.
癌细胞条件培育液的搜集以2×105/孔的密度将细胞种植于6孔培育板中，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培育基培育长至60%密度时，镜下观看见细胞贴壁良好，以无血清DMEM洗3遍，每孔再加入DMEM(无血清，含有不同浓度genistein)1mL，继续孵育48h，搜集培育上清液并活细胞计数，以3000r/min，离心5min去除细胞碎片，以细胞数为依据调整体积，分装后立刻进行酶谱分析或冻存于-80℃备用.
明胶酶谱活性分析将细胞条件培育液上样于100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶(胶中含1g/L的明胶，明胶是IV型胶原酶底物)，4℃条件下，浓缩胶90V，分离胶140V恒压电泳，电泳后，将凝胶于含有25mL/LTritonX-100的洗脱液内振摇洗涤3次，每次30min.孵育液(50mmol/LTris cl，5mmol/LCaCl2，LZnCl2，内37℃孵育18h；1g/L 考马斯亮蓝R250染色，300mL/L甲醇、100mL/L乙酸脱色，干燥保留.为了尽可能幸免误差，每组细胞均设3个以上平行样本，并经多次重复实验.
运算机图像分析运用德国产LEICAQ550IW图像分析仪对明胶酶谱图像进行吸光度(A)测定，依照公式计算各条带的积分A值.积分A值=平均A值×面积［2］.
统计学处置：数据均以x±s表示，软件对其进行t查验，P<
为不同具有统计学意义.
2结果
对MDA MB231细胞侵袭能力的阻碍侵袭实验结果显示，实验组与对照组细胞均能够侵袭至铺有Matrigel滤膜上（图1）.24，48，72h3个时刻点上的侵袭细胞数，genistein15μmol/L组为（245±12）个，（300±20）个，（378±18）个；30μmol/L组为（155±20）个，（204±30）个，（256±μmol/L组相较较，genistein15μmol/L和30μmol/L组侵袭细胞数均显著减少(P<，且随着药物浓度的增加，侵袭细胞数慢慢减少，组间不同具有7统计学意义(P<，图2).
对MDA MB231细胞基质金属蛋白酶MMP2，MMP9的表达阻碍在药物作用48h后，MDA MB231细胞基质金属蛋白酶蛋白表达，15μmol/L，30μmol/L组MMP2蛋白相对灰度值（相关于内参βactin）别离为±，±；MMP9蛋白相对灰度值别离为±，±.与0μmol/L相较较，基质金属蛋白酶蛋白MMP2和MMP9表达慢慢减弱，不同具有统计学意义(P<，图3).
对MDA MB231细胞分泌MMP2，MMP9活性的阻碍酶谱分析结果显示，在72×103和92×103处有两条透明条带，别离代表活性形式的MMP2和MMP9.在药物作用48h后，15μmol/L和30μmol/L组明胶酶的活性明显低于0μmol/L组（P<，图4）.在酶谱分析的酶缓冲液中，假设加入基质金属蛋白酶的抑制剂EDTA(终浓度10mmol/L)，其他条件和进程不变，那么无条带显出.实验重复3次，所得结果具有相同趋势. 3讨论
genistein是目前唯一在大豆中含有的植物雌激素，具有防癌、抗癌和抗纤维化作用的豆科植物［3-4］.豆类食物的高消费与包括乳腺癌在内的多种肿瘤发生风险呈明显负相关，而genistein可能是造成这种癌低发病率的重要缘故［5］.但其具体机制尚不清楚.研究［6-7］说明，genistein具有抑制卵巢癌细胞SKOV3，胃癌细胞SGC7901等的体外侵袭能力.咱们的研究结果显示，genistein能显著抑制MDA MB231细胞的体外侵袭能力，且呈现明显的剂量效应关系，进一步证明了genistein潜在的肿瘤侵袭转移抑制作用.
侵袭和转移是恶性肿瘤的一个重要特点，也是其致死的要紧缘故.阻碍侵袭转移的因素很多，而MMPs表达改变，尤其是MMP2和MMP 9表达升高，降解基底膜中的Ⅳ型胶原能力增强是癌细胞侵袭与转移的关键步骤.已有研究［8］发觉，乳腺癌组织MMP2和MMP
MB231细胞，检测MMP2，MMP9蛋白表达情形，结果说明，随着genistein作用浓度的增加，MMP2和MMP2，MMP9的翻译，降低细胞内基质金属蛋白酶的产生.同时本研究还采纳酶谱法对肿瘤细胞分泌MMP活性进行检测，结果说明不同浓度genistein处置后，乳腺癌MDA MB231细胞分泌MMP2，MMP9的活性显著降低.综合以上结果能够看出：乳腺癌MDA MB231细胞侵袭转移潜能与其产生MMP的能力紧密相关，genistein抑制了MDA MB231细胞MMP2，MMP9两种酶的表达，降低了其分泌活性，使得肿瘤细胞穿过人工基底膜的能力下降，进而抑制侵袭转移能力.
综上所述，genistein是一种对肿瘤细胞侵袭转移阻碍较大的植
物提取药物，其在抑制细胞生长作用的同时，可通过抑制MMP2和MMP9表达和分泌活性，达到抑制乳腺癌细胞侵袭转移的目的.
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