基于血管生成探讨补肾养精颗粒对早发性卵巢功能不全大鼠模型的影响

C Modernization o f Traditional Chinese Medicine and Materia Materia-World Science and Technology 1333
2 0 2 1 第 二 十 三 卷 第 四 期 * V 〇l. 2 3 N 〇.4
表 2 补 肾 养 精 颗 粒 对 大 鼠 动 情 周 期 的 影 响 (i ±
世界科学技术-中医药现代化★专题讨论五:动物模型研究
随机分组 空白组 模型组 BSYJKL-Low BSYJKL-Medium BSYJKL-High 补佳乐组
表 1 P〇 _ 造 模 及 药 物 干 预 具 体 方 法
动情周期筛选 卜7 天
造模 生理盐水灌胃 50 m g .kg_l雷 公 藤 多 苷 灌 胃 5 0 m g .kg-1雷 公 藤 多 普 灌 胃 5 0 m g .kg_l雷 公 藤 多 香 灌 胃 5 0 m g .kg-1雷 公 藤 多 苷 灌 胃 5 0 m g .kg-1雷 公 藤 多 苷 灌 胃 8-21 天
收 稿 日 期 =2020-02-13
修 回 日 期 ：2 0 2 丨- 0 3 - 2 1
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山 东 省 科 学 技 术 厅 山 东 省 重 点 研 发 计 划 （2 0 1 9 G S F 1 0 8 2 0 8 ) : 基 于 H e d g e h o g 信 号 通 路 调 控 颗 粒 细 胞 凋 亡 探 讨 补 肾 养 精 颗 粒 治 疗 早 发 性 卵 巢 功
关键词：补 肾 养 精 颗 粒 早 发 性 卵 巢 功 能 不 全 血 管 的 形 成 凋 亡 doi: 10.11842/wst.20200608007 中图分类号：R289 文献标识码： A
早 发 性 卵 巢 功 能 不 全 （ premature ovarian insufficiency,POI)是指 女 性 4 0 岁之前出现4 个月以上 的 闭 经 或 月 经 稀 发 ，且 连 续 2 次 的 血 清 FSH水 平 > 25IU/L(间隔4-6周 V"。其临床以月经异常为主，可伴 有 潮 热 、盗 汗 、性 交 不 适 ，阴 道 干 涩 ，睡眠不佳等雌激 素缺乏的症状|21,甚 至 引 起 不 孕 ，发 病 率 为 丨％131，且逐 年 上 升 ，是 妇 科 常 见 的 疑 难 病 种 ，严重影响女性的身 心 健 康 和 生 活 质 量 。近 年 来 ，随 着 社 会 的 快 速 发 展 ， T .作节奏的加快，加之环境因素等综合影响，P0 1 的发 病 率 逐 年 升 高 ，且有向 低 龄 化 发 展 的 趋 势 ' 目前针 对 P0 I缺 乏 有 效 的 治 疗 手 段 ，常规激素补充治疗可缓 解 患 者 雌 激 素 缺 乏 的 症 状 ，但 无 法 重 建 患 者 卵 巢 功
摘 要 ：目 的 基 于 血 管 生 成 及 凋 亡 相 关 因 子 探 讨 补 肾 养 精 颗 粒 治 疗 早 发 性 功 能 不 全 的 机 制 。 方法 选定动情周期正常的6 0 只 SD雌性 大 鼠 ，随机分为空白组、模 型 组 、补肾养精颗粒组（低剂量组（1.75 g.kgM )、 中剂量组（3.50 g.kg—1)、高剂量组(7.00 g.kg—1)、补佳乐组。通过阴道涂片观察动情周期的变化；ELISA检测大 鼠血清 E2、AMH、NF- kB、 MMP- 2 、Caspase- 3 、Caspase-9 浓 度 ； Western blot 检测卵巢组织中 MMP- 2 、MMP- 9 、 VEGF、Caspase- 3 的 表 达 ；HE染色观察大鼠卵泡发育及血管分布情况。结 果 ① 模 型 组 大 鼠 的 动 情 周 期 明 显 延 长 ，予补肾养精颗粒干预后明显缩短;②模型组的血清E2、AMH、NF- kB 、MMP- 2 浓度较低，予补肾养精 颗粒干预后其表达升高（P <0.05);③模型组的Caspase- 3 、CaSpase- 9 表达偏高，予补肾养精颗粒干预后其表 达降低（ P < 0.05);④ 在 卵 巢 组 织 MMP- 2 、M!VIP- 9 、VEGF的蛋白含量方面，模型组均低于空白组，予补肾养 精颗粒干预后其表达升高；⑤ 在 HE 方 面 ，模型组的卵泡数目及血管较少，予补肾养精颗粒干预后可改善。 结 论 补 肾 养 精 颗 粒 可 通 过 升 高 血 管 生 成 相 关 因 子 NF-/cB、MMP- 2 、MMP- 9 、VEGF的表 达 ，降低凋亡相关 因子Caspase- 3 、Caspase- 9 的表达，进而改善血清E2 、AMH水平，促进印巢血管的形成及卵泡的发育。
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材料
1 . 1 实验药物 ① 雷 公 藤 多 苷 片 ：10 mg/片 （远大医药黄石飞云
制 药 有 限 公 司 ，20190110);② 戊 酸 雌 二 醇 片 （补佳 乐 ），1 mg/粒 ，拜 耳 医 药 保 健 有 限 公 司 广 州 分 公 司 分 包装生产，生 产 批 号 :352A ;③ 补 肾 养 精 汤 :熟 地 12 g 、 当 归 12 g 、白 苟 12 g 、川 等 9 g 、冤 丝 子 18 g 、枸杞子 15 g 、盐 车 前 子 6 g 、制 五 味 子 9 g 、覆 盆 子 9 g J I |牛膝 15 g 、醋 香 附 12 g 、炒 枳 壳 12 g 、党 参 12 g 、炙淫羊藿 12 g 、盐 知 母 12 g 、益 母 草 15 g ,广州一方药业中io，提 供 ；\1\1卩-2(匕8-459州）、。35?3363 (Bsm-33284M) ,Goat Anti-Rabbit IgG(H+L ) HRP (bs-40295G-HKP),均由 Bioss提供 。 1 . 4 仪器
全 波 长 酶 标 仪 ，赛 默 飞 世 尔 科 技 有 限 公 司 ；电泳 仪 ，美 国 伯 乐 公 司 ；化 学 发 光 成 像 仪 ，日本富士公司； 显微 镜 ，徕卡生物系统有限公司。
模 型 制 备 :按 照 参 考 文 献 |81，空 白 组 大 鼠 予 生 理 盐 水 灌 胃 ；其他各组大鼠给予雷公藤多苷混悬液50 mg(kg•天广灌胃，连 续 14天 。
药物干预：中 药 192 g ,相当于配方颗粒33.3 g。参 照 人 与 动 物 之 间 药 物 剂 量 换 算 方 法 ，分 别 灌 服 补 肾 养 精颗粒 1.75 g.(kg•天广、3.50 g .(kg•天）' 7 . 0 g .(kg天广、补 佳 乐 0.1 mg-(kg•天）_|，连 续 15天 。余两组予 生理盐水灌胃3 2 . 3 取材时点
ELISA 试 剂 盒 ：E2(RA20666)、AMH(RA20211)、 NF- kB (RA2 0 1 7 0 ) 、MMP-2 (RA2 0 5 0 2 ) 、Caspase-3 (RA20292)、Caspase- 9 (RA20290)均由武汉贝茵莱生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 ；全 蛋 内 提 取 试 剂 盒 （BC3710-
能 不 全 的 机 制 研 究 ，负 责 人 ：刘 金 星
* * 通 讯 作 者 ：刘 金 星 ，医 学 博 士 . 教 授 ，主 要 研 究 方 向 ：中 医 药 治 疗 月 经 病 、不 孕 症 研 究 ：
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1 于血管生成採付补腎养精颗粒对早发性 卵巢功能不全大氮模型的影响*
S 张 芳 、 刘 震 2， 于 潇 2， 丁 怡 2， 张 毅 然 石 雅 馨 、 刘 金 星
( 1 .山东中医药大学第一临床医学院济南250014; 2 . 山 东 中 医 药 大 学 附 属 医 院 济 南 250014)
7 - 8 周 龄 SPF级 SD雌 性 大 鼠 （购自济南朋悦实验 动 物 繁 育 有 限 公 司 ，生 产 许 可 证 号 :SYXK(鲁 ）2014 0007)，体质量（180-200) g。动物词养环境：山东中医 药 大 学 附 属 医 院 动 物 房 词 养 ，将 室 温 控 制 在 20尤 24T ,相 对 湿 度 维 持 在 45%-55%。造模时间均选择大 鼠动情前期。 1 . 3 试剂
补肾养精颗粒干预的第1、3 、5 、7 、9 、11、13天阴道 涂片观察动情周期的变化;药物干预结束48 h 内处死 大鼠： 2.4 检测指标
用 1 0 % 水 合 氯 醛 注 射 大 鼠 腹 腔 ，麻 醉 后 固 定 大 鼠 ，将 大 鼠 腹 中 部 皮 肤 去 毛 ，常 规 消 毒 ，铺 巾 ，切口进 腹 ，暴 露 卵 巢 ，肉眼大体观察大鼠卵巢情况后，剪取大 鼠 卵 巢 ，并 采 集 腹 腔 静 脉 血
= 10)
分组
动 情 周 期 /天
空白组
3.8 ± 1.08
模型组
8.4 ± 0 . 8 4 * *
BSYJKL-Low
7.00 ± 0.67* * AA
BSYJKL-Medium
5.70 ± 0.94* *AA
BSYJKL-High
6.6 ± 1.07* * AA
补佳乐组
4.8 ± 0.79* AA
巢功能，提高妊娠率171。历代妇科医家均倡导“女子以 血 为 本 ”，就 “血 ”的 物 质 属 性 — 滋 养 、循行功能而 言 ，上述之“血”与血液之“血 ”具有一定的相似性。基 于 二 者 相 似 的 功 能 及 精 血 同 源 理 论 ，在 上 山 东省重点 研发计戈ij(2019GSF108208)的 支 撑 下 ，预从血管生成 及凋亡相关因子角度进一步阐述补肾养精颗粒改善 POI模 型 大 鼠 卵 巢 功 能 的 机 制 。
药物干预 生理盐水灌胃 生理盐水灌胃 1.75 g.kg-1补 肾 养 精 颗 粒 低 剂 量 灌 胃 3.50 g.k f 补 肾 养 精 颗 粒 中 剂 量 灌 胃 7.00 g.kg」补 肾 养 精 颗 粒 高 剂 量 灌 胃 0.1 m g .kg-1补 佳 乐 灌 胃 22-36 天
灌注参数高于健康妇女,且血清VEGF含量较低。 补肾养精颗粒具有补肾填精之效,可改善患者卵
， ， ， ， 注 ：与 空 白 组 相 比 ，*尸 < 0 .0 5 * * P < 0 .0 1 与 模 型 组 相 比 AP < 0 .0 5 AAP <0.01
能 在 新 版 2017早发性卵巢功能不全的临床诊疗中 国专家共识，指出“中药可做为一种治疗P0 丨的非激素 药 物 ”丨5丨。
目前引发P0 I 的 机 制 尚 不 明 确 ，现代医学主要从 遗 传 因 素 、医 源 性 因 素 、免 疫 因 素 、环境因素等进行研 究 。P0 I 是 一 个 过 程 ，绝 非 一 个 事 件 。各种病因引起 的 P0 丨,均以卵巢中的卵泡发育不良或闭锁太快为特 征 。初级卵泡(致密无血管）逐渐发育为次级卵泡(有 血 管 ）的 过 程 中 ，卵泡液的形成及卵泡的成熟均离不 开血管的供养，卵巢血管生成对卵泡发育起着至关重 要的作用161。现 代 研 究 发 现 ，卵巢血流灌注指标对卵 巢 储 备 功 能 具 有 一 定 预 测 作 用 ，P0 I 患者的卵巢血流
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方法
2.1 动物分组 常 规 饲 养 1周 适 应 环 境 后 ，挑选动情周期正常大
鼠 ，随 机 分 为 正 常 组 、P0 I 模 型 对 照 组 、补肾养精颗粒 高 剂 量 组 （ BSYj KL-High) ,补 肾 养 精 颗 粒 中 剂 量 组 (BSYJKL- Medium) ，补 肾 养 精 颗 低 剂 量 组 （BSYJKLLow),补佳乐组，各 10只 ，分别编号、称重。 2 . 2 动物干预