鹿茸等动物生药鉴定方法的研究进展

鹿茸等动物生药鉴定方法的研究进展
鹿茸等动物生药鉴定方法的研究进展
摘要:鹿茸是传统名贵中药材。

我国在2010年版《中华人民共和国药典》中规定了梅花鹿茸、马鹿茸为正品药材。

由于鹿茸及产品需求量增加，使得伪品、混淆品和代用品在国内的中药源市场屡见不鲜，导致了中药材市场的混乱。

这种现象也见于其它名贵中草药材，如人参、鹿鞭、龟甲以及貂心等，严重影响了中国传统药学的美誉，更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化的发展。

因此提供简捷、精准的鉴定方法为净化中药材市场、发扬光大我国的传统中药具有极其深远的意义。

关键词:鹿茸；鉴别；综述
鹿茸系脊索动物门哺乳纲鹿科动物中雄鹿未骨化的密生茸毛的幼角。

梅花鹿茸（黄毛茸），主产于吉林、辽宁等省；马鹿茸（青毛茸），主产于黑龙江、吉林、内蒙古、新疆、云南、甘肃等省。

可依据是否排血处理分类为排血茸片或者带血茸片。

鹿茸之所以是名贵中药材主要是因为含有多种化学成分[1]，例如具有蛋白质属性的酶类：6-磷酸葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、碱性磷酸酶以及琥珀酸脱氢酶等。

多种单糖及其衍生物：如己糖，戊糖、己糖胺、糖醛酸、中性糖、氨基葡萄糖以及半乳糖胺等。

气相色谱法已经确定梅花鹿茸中具有8种脂肪酸组分，其中油酸、亚油酸、亚麻酸含量较高，这是人体必需的脂肪酸。

用高频电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-AES）测定后发现梅花鹿茸含有16种微量元素，其中钙含量最高，其次是磷元素。

钠、钾、镁含量也比较丰富。

锂、锌、铜、钴、镍、锰的含量相对较低。

有文献报道鹿茸中也含有胆固醇、雌二醇-17β、雌酮、孕酮、睾酮以及雌二醇等。

鹿角是哺乳动物中唯一能够再生的器官，因为鹿茸中不仅含有神经生长因子（Neuron growth factor ，NGF）[2]、也含有表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)[3]。

NGFmRNA在生长的鹿角尖端小动脉平滑肌细胞内表达比较旺盛。

显然诸多的化学成分赋予鹿茸多种药理作用，并因此成为传统名贵中药：
加速物质的代谢、产生能量，有利于损伤细胞的修复。

NGF 以及丰富的钙离子尤其对于骨组织损伤修复具有重要的意义；能够提升机体的免
疫功能这是鹿茸的另一重要药理学作用。

因为免疫球蛋白的形成需要糖类物质的参与，而鹿茸正是含有丰富糖类的物质；鹿茸中的琥珀酸脱氢酶(SDH),多糖(PSR)可参与细胞内的抗氧化代谢过程，因此鹿茸也具有延缓衰老的作用[3]。

激素以及具有性激素样物质可以增强细胞内物质代谢的信号传递，以此调节细胞内糖、脂肪以及蛋白质代谢水平。

由于鹿茸产源不足但是需求量增加，使得不同渠道来源的伪品、混淆品和代用品在国内的中药源市场屡见不鲜，鱼目混珠。

但价格依旧昂贵却完全失去鹿茸的有效成份和药用效果。

这不仅延误病人的救治、而且降低人们对中药的信任。

2008年中医中药已被美国、加拿大等国家承认并接纳。

如何在全世界弘扬光大我国传统的中医中药学？建立客观、标准、规范化的质量控制体系意义重大。

本文就鹿茸的传统生药鉴定诸如基源鉴定、性状鉴定等以及现代分子生物学技术的应用做一综述。

期待为动物生药的规范化质量控制提供新的思路。

1、基源鉴定
基源鉴定是通过观察样品、标本、核对文献等对生药进行来源鉴定。

基源鉴定为生药生产，资源开发和利用提供依据。

这种鉴定对于近缘物种、易混淆品种，显示较大的局限性和片面性。

2、性状鉴别
性状鉴别是对生药的外观形态、气、味、色泽、质地以及断面的感观特征进行综合从而得出结论的一种方法。

吴水根等应用这种经典的方法为鹿茸饮片的真伪鉴别提供了大量的信息。

陈斌等应用性状鉴别的方法，揭露了鹿茸伪品的制作：鹿角切片后，胶以外皮，便冒充鹿茸饮片作为生药销售。

显然性状鉴别简便，快捷。

但主观性强，结果的准确性主要取决于鉴定者的经验。

对极易混淆的近缘种以及破碎、粉末或腐烂等生药的鉴别往往难以适从。

3、显微鉴别
显微鉴别是利用显微镜观察药材的内部组织构造、细胞形态，从
而进行品种和质量的鉴定方法。

显微鉴别法适用于外形不易鉴定、药材破碎或呈粉末状的中
药。

鞠春天等通过对花茸片、马茸片、驯鹿茸片的茸毛的中部直径、鳞片排列方式、髓质形状等的显微观察，提供了鹿茸片与驯鹿茸片鉴别要点。

王海生等通过显微观察是否有植物组织的结构特征用以鉴别正品鹿茸和伪品鹿茸。

宏惠田等详尽描述了鹿茸的表皮角质层、毛茸毛干中部直径、骨碎片、未骨化组织、角化梭形细胞等的显微特征。

郭彩玉则应用光镜和扫描电镜对鹿茸制成的组织切片进行观察，提供了鹿茸的组织结构，特别是茸皮组织和茸骨组织两部分结构特征，这样从微细形态学领域补充了可用于生药鉴别的知识。

但是这一方法不能揭示细胞内在的信息，因此无法完成近源物种的精准鉴别。

4、理化鉴别
理化鉴别是利用物理或化学的方法，对生药及其制剂所含主要化学成分或有效成分进行定性和定量分析，评定生药品质优良度的一种方法。

一般应用于含不同化学成分的生药鉴定、生药同名异物或性状相似又无明显显微特征的生药鉴别。

理化鉴别方法的原理是基于样品所含有的特征性成分从而进行化学反应显色、光谱吸收分析（荧光、紫外光谱）或者对样品薄层分离后再进行化学反应显色等。

例如刘国强等[4,5]利用硅胶G薄层板，以正丁醇-冰醋酸-水(3∶1∶1)为展开剂对鹿茸的抽提物进行分离，经过茚三酮显色法或者硫酸铜显色法定位了某些氨基酸的分布及RF徝，为鹿茸氨基酸的分析提供了有价值的数据与鉴别标准。

根据物质的结构会显示特定光谱的吸收原理，陈代贤对13种鹿茸片分别进行抽提，然后进行荧光光谱的吸收扫描，由此获得了13种鹿茸的荧光光谱。

周仰青等利用紫外分光光谱法检测鹿茸提取物，由此在光谱学领域增添了鹿茸特征性的紫外吸收光谱。

赵义等对花鹿茸、马鹿茸、市售鹿茸片、鹿茸粉按照一定的提取方法抽提后进行紫外光谱检测，发现200~350nm为主要吸收光谱域。

张丽应用粉末X射线衍射Fourier指纹图谱鉴定法对3个马鹿茸和1个花鹿茸中药材进行分析鉴定，获得了马鹿茸X射线衍射Fourier指纹图谱及特征标记峰值。

但是X射线衍射技术需要的仪器设备昂贵，不能做到即
时监测，更不能普及应用。

综上所述，光谱技术用于鹿茸成分的分析报道较多。

由于鹿茸含有比较复杂的成分，特别对于极易混淆的近缘种，仅仅依赖光谱分析难以达到精准的判断。

结果的重复性不理想也是光谱学技术仍未作为国家鉴定标准方法的主要原因。

但是应用理化方法可以判断
样品含有化学成分的性质和类型，这有助于发现新药源或寻找代用品。

5、生物化学与分子生物学技术的应用
中药的传统鉴定主要利用植物或动物形态学和解剖学特征，从基原、性状、显微以及理化等方面进行分析判断。

大部分药材经加工、炮制等处理后，往往失去原来的形态和解学剖特征，甚至显微特征也会发生改变，从而使药材的真伪优劣难以鉴别。

生物化学分析技术-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳曾一度应用鹿科动物血清同工酶谱或者血清蛋白分析。

1996年张俊才等对白唇鹿、马鹿、梅花鹿血清中的酯酶、碱性磷酸酶、淀粉酶等做了同工酶谱电泳研究，试图通过多态差异建立鉴别标准，但这需要大量的试验数据积累。

王宗仁等[6]对黑鹿、日本梅花鹿、东北梅花鹿、麋鹿等的2个亚科、4个属、7个种进行了血清蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

结果表明，鹿的血清蛋白可分辨出多至53个蛋白区带。

其中最少的是白唇鹿，黇鹿约为24条，最多的是日本梅花鹿约为35条。

而不同样品显示相同条带数目也是不可避免的。

显然一维(单向)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳作为鉴定方法学，其特异性令人质疑。

20世纪迅速发展的分子生物学技术由于其精准及操作简单等优势广泛应用于生物学领域，如临床疾病的诊断，特别在肿瘤、心血管疾病等疾病机制的研究领域显示广泛的前景。

与此同时分子生物学技术也被用于中药鉴别、品种改良、人工资源培育的研究。

由于哺乳动物的性别决定基因(Sex-determining region of Y Chromosome，SRY)仅含有一个开放阅读框架(Opening reading frame，ORF)，ORF基因序列又高度保守。

于是许多研究者锚定Sry。

2001年郭金虎等人[7]报道了赤麂Sry测序并且与部分偶蹄动物Sry序列的比较。

之后张敏
等人[8]报道了梅花鹿茸和赤鹿茸Sry序列存在的差异。

白秀娟等人[9]从梅花鹿、新西兰鹿、俄罗斯驯鹿的鹿茸饮片中提取DNA，在相同条件下用特异引物扩增Sry，发现DNA条带数目存在明显差异。

除了Sry外，动物线粒体DNA(mtDNA)积聚突变速度比相应的核DNA(nDNA)快5～10倍，对于关系密切的物种容易区分。

因此mtDNA成为研究者的另一目标。

例如李波等[10]运用细胞色素b基因(Cyt b)和12s核糖体RNA(12s rRNA)基因鉴别梅花鹿和马鹿的研究:采用PCR和直接测序技术获得了8份嫌疑样品402bp Cytb基因序列，并与来自GenBank数据库27份同源的Cytb基因
序列进行比对。

3份嫌疑样品与梅花鹿的核甘酸距离值相同（0.026±0.006），小于梅花鹿与东部马鹿间最小的核甘酸距离值（0.036）。

分析表明这些样品与梅花鹿聚为一枝，因此可以推测它们来源于梅花鹿。

同样的方法得出另3份嫌疑样品来源于马鹿。

然后再应用同样的技术对12srRNA基因的系统学和核甘酸距离分析，验证了Cyt b分析结果是正确的。

应用通用引物L14841和H15149，王义权从乌梢蛇及其他标本中提取DNA，扩增得到约308bp的Cyt b基因片段，测序后应用分析软件MAGA统计各样品DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数。

结果表明Cytb 基因片段序列是鉴别蛇类动物药源的良好分子标记。

除了Cytb外，他们也应用12SrDNA基因片段，研究了金钱白花蛇、龟甲、鳖甲、海马等中药。

2003年，加拿大科学家Hebertz[11-13]从GeneBank保存的一些动物序列中发现某一区域在不同物种中高度可变，而在物种内部几乎不变。

而且发现在物种内部和物种之间的变异中有一种相似的序列分歧。

于是Hebertz试验小组构思了DNA条形码计划，并实施了对鸟类、鱼类、水蛭等的鉴定。

之后在他们的论文中提出了一种通用性的动物条形码：动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基1 （cytochrome c oxidase subunit 1，COI）。

COI是线粒体中约650bp的一段序列。

之所以成为极具吸引力的条形码候选物，是因为这种扩增基因片段的引物可以在许多动物种类中成功运用。

由于这种基因的进化速度比Cyt b基因更快，因此可以用来区分进化非常紧密的物种。

于是这种方法很快被引用到动物生药的识
别与鉴定领域。

夏云等[14]2010年研究并报道了DNA条形码技术在蛤蚧原动物及其伪品鉴别的应用，结果证明这是一种迅速、低廉、准确的鉴别方法。

2011年张蓉等[15]人在中国药学杂志报道了鹿茸饮片DNA条形码研究：采用线粒体COI基因，在靠近5'端设计了一对鹿类DNA条形码通用引物，对来源于鹿科动物3个属共计19份样本的鹿茸进行PCR扩增和序列测定，结果证明除梅花鹿、马鹿的个别样本外DNA条形码鉴别方法对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定。

目前，DNA条形编码研究计划在世界范围内发展迅速。

生命条形码数据库中，已有超过30万条条形码序列。

6、讨论与展望
中药材资源包括植物与动物两大类。

而动物生药往往是生药中较为珍贵的部分。

但是动物生药基源品种繁多，种间形状相似度较高，毒副作用以及药效差异
很大。

因此建立准确可靠的鉴定方法，对鹿茸、龟甲及貂心等名贵动物药材进行正本清源，保障药材质量具有重要的意义。

传统鉴定方法往往特异性不强、通用性差等不利于规范化、标准化方法的建立及普及。

目前分子生物学技术以其诸多的优势引领着该领域的研究。

这是因为任何一个生命个体，无论它处于怎样的生长期、体现出何种形态，它的每个部位的DNA序列都是完全一致的，这就降低了对样品采集的要求。

特别对于干燥的或者已经处理过的药材，仍然可以通过浸泡、破碎细胞去获得可以进行分析的原料－nDNA、mtDNA或者叶绿体DNA （cpDNA）。

DNA分子高保真性结构为获取精准分析结果提供了保障。

DNA分子内目标序列的分析只需要一对引物或者几对引物扩增后，即可进行测序比对，方法简便易行。

Sry、Cytb、12srRNA以及COI等都已经显示了可操作性。

其中COI 更具潜质，因为这种扩增基因片段的引物可以在许多动物种类中成功运用。

由于这种基因的进化速度比Cytb基因更快，因此可以用来区分进化非常紧密的物种。

但是基础基因不可能覆盖所有变异物种的DNA序列，因此导致任意一种DNA片段的分析或多或少显示重复操作结果的差异。

相信随着DNA条形码等技术的不断完善，建立和推广客观化、规范化与标
准化的中药鉴定体系指日可待。

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序列的比较[J].动物学报,2001,47(2):145-149.
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