STED与STORM显微成像技术的生物医学应用研究进展

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•综述•
STED与STORM显微成像技术的生物医学
应用研究进展
任万奎u董科显傅松滨“2
1哈尔滨医科大学医学遗传学研究室150081 ;2中国遗传资源保护与疾病防控教
育部重点实验室（哈尔滨医科大学）150081
通信作者：傅松滨，Email:fusb@em s•hrbmu•e d
【摘要】在生物医学研究中，显微成像仍是最常用的技术之一。

由于衍射极限的存在，
光学显微镜的分辨率长期被限制在200 n m。

近年来，突破衍射极限的超高分辨率显微成像
技术的发展与应用，推动了生物医学研究的进展。

本文主要对受激发射损耗（stimulated emis­
sion depletion，STED) 和随机光学重建（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM) 两类超
高分辨率显微成像技术的成像原理、生物医学应用、优劣势比较及应用局限性进行探讨。

【关键词】STED;STORM;超高分辨率成像；显微成像技术；生物医学应用
基金项目：中国遗传资源保护与疾病防控教育部重点实验室专项基金资助（LPHGRDC2020-
003)
D0I ： 10. 3760/c m a. j. cn23 1 536-20200705-00055
Research progress on STED and STORM microimaging techniques in biomedical application
Ren Wankui12，Dong Kexian1’2, Fu Songbin1，2
1Laboratory o f Medical Genetics，Harbin Medical University •，Harbin 150081，China ;2Key laboratory o f
preservation o f human genetic resources and disease control in China ( Harbin Medical University ) , Ministry o f
Education , Harbin 150081, China
Corresponding author ： Fu Songbin , Email：fusb @ ems. hrbmu. edu. cn
【A bstract】Microscopic imaging is still one of the most commonly used techniques for biological
study. Due to the existence of diffraction limitation , the resolution of optical microscope has long been limit­
ed to 200 nm. In recent years , the development and application of new imaging technologies have broken
the diffraction limitation and promoted biomedical research significantly. This article mainly discusses the
imaging principles , biological applications , comparison of advantages , and application limitation of super-
resolution microscopy with stimulated emission depletion ( STED ) and stochastic optical reconstruction mi­
croscopy (STORM ).
【K eyw ord s】STED; STORM ；Super - resolution imaging ；Microimaging technique ；Biomedical ap­
plication
Fund program ：Research Found of Key Laboratory of Preservation of Human Genetic Resources and
Disease Control ( LPHGRDC2020-003 )
DOI ：10. 3760/c m a. j. cn23 1 536-20200705-00055
显微镜根据照明源可分为光学显微镜和电子显微镜。

衍射极限的存在使光学显微镜的分辨率限制在200 n m[l]。

虽然应用电子显微镜可观察到纳米级及以下的超微结构，但所用样本需要经过复杂的制作步骤，致使电子显微镜下无法观察连续演变的生物学过程[2]。

因此，高分辨率且可用于观察活体样本的显微成像技术一直是研究者关注的方向。

随着成像方法的
国 _遗传学朵志2U2U 年 12 月 15 H弟43 存弟6期丨ntj Genet Dec. 15 ,2020, Vol. 43 ,No. 6• 345 -
更新、荧光探针的改进以及计算机算法的优化，超高分辨率显微成像技术得以发明，可在 分辨率达到纳米级的同时观察活体细胞连续的生命活动[3]。

本文对受激发射损耗（stim ulated em ission dep letio n, STED)和随机光学重建（sto­chastic optical reconstruction microscopy , STORM) 显 微成像技术的生物医学应用、优劣势对比、现 阶段存在的问题及发展方向进行综述。

1超高分辨率显微成像技术
I873年，德国科学家A bbe发现单个点光源经过透镜组和物镜汇聚后在焦平面上产生一个模糊的衍射斑点，这个斑点的大小限制了人类能够分辨的两个或两个以上物体的最小距离，因此光学显微镜的理论分辨率被限制在200 ru n,即衍射极限[1]。

近年来，众多全新的显微成像技术突破了衍射极限，推进了显微成像领域的发展，这些技术被命名为超高分辨率显微成像技术。

以STED为代表的点扩散函数修饰（point spread function modification，PSFM )显 微成像技术和以STORM为代表的单分子定位(single molecule localization，SML )显微成像技术在生物医学领域的应用较为广泛。

1.1S T E D显微成像技术
1.1.1S T E D显微成像原理S T E D显微成像技术是通过缩小衍射斑点来提高分辨率的。

生 物样本的荧光成像由多个光点构成，光学系统中可以根据数学模型将这些光点转化为点扩散函数（point sp rea d f u n c t i o n，P SF)。

1994年，Hell 等[4]提出在一束点扩散函数P S F1光的基础上，用另一束点扩散函数P S F2环状光抵消P S F1的外围，而只保留P S F1中心发出的光。

这一理论 转化为实际过程，即用一束激发光将荧光分子从基态切换为激发态来使荧光物质发光，同时 用另外一束环状淬灭光将周围荧光物质从激发态切换为基态，借此将处于激发态的中心荧光分子与处于基态的周围荧光分子区分，缩小了 衍射斑点，从而提高显微镜的分辨率。

1999年，H e l l根据此原理发明了S T E D显微镜[5]。

1.1.2S T E D显微成像技术的生物医学应用
S T E D显微成像技术为观察细胞间物质传递、蛋白质和核酸的超微结构以及蛋白质间相互作用带来突破性进展，其最显著的优势是可以观察活细胞内实时变化的生命活动。

细胞间物质传递一直是生命科学研究的重点。

应用STED显微成像技术观察海马神经元突触囊泡中的突触结合蛋白，发现无论神经末梢处于静止还是活跃状态，突触结合蛋白均在突触前膜保持簇状排列[6]。

果蝇细胞中U n c l3A蛋白参与神经递质的释放，应用双色STED显微成像技术可见U n c l3A与同工酶U n c l3B通过协同调节突触小泡与钙离子通道的距离来确定突触小泡释放位点[7]。

进一步观察发现U n c U A蛋白的氨基端精准定位于活性区，而羧基端产生突触小泡的释放信号[8]。

S T E D显微成像技术的应用使得对蛋白质和核酸的观察精细到纳米级。

应用S T E D显微 成像技术，发现线粒体内膜上MitGfilin、M I N O S l 和CHCHD3蛋白成簇排列[9]，核孔的排列呈现经典的八重对称结构[1<>],中心粒远端的C e p l64蛋白位于直径300 n m的九重对称排列环中[11]。

用荧光蛋白标记小鼠视觉皮层树突细胞中丝状肌动蛋白，S T E D显微镜下可以观察到肌动蛋白在活体小鼠中的存在情况[12],进一 步观察发现肌动蛋白呈环状，其结构周期频率为192 n m[13]。

近年来，S T E D显微成像技术与DNA拉伸方法的联合应用，使核酸片段的长度得到精确测量[14]。

S T E D显微成像技术对于细胞器间和蛋白质间的动力学观察也具有重要意义。

细胞融合在许多生物学过程中扮演着重要角色，Shin 等[15]利用S T E D显微成像技术首次在镜下观察到神经内分泌细胞动态融合的现象。

结合荧光光谱技术与S T E D显微成像技术对小鼠神经突触进行成像，可见神经元树突细胞在受到刺激后，其突触后膜上脂质双分子层具有可塑性[16]，而突触前膜和突触后膜蛋白质N M D A可 以与N M D A受体成比例结合，使得突触具有可塑性和记忆功能[17]。

应用双色S T E D显微成像技术可观察纤毛中肌动蛋白与其结合蛋白M y〇5a的相互作用[18],正常细胞中高尔基体从细胞中心转移到细胞表面的过程[19]、内质网与 线粒体间动态的相互作用[M]，凋亡细胞中B a X 蛋白与线粒体膜蛋白T o m20的互动关系[21]。

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1.2 STORM显微成像技术
1.2.1 STORM显微成像原理2006年，庄小 威实验室提出STORM显微成像理论：通过控制 激发光的发射，使单位时间内的单个荧光团首先处于激活状态，采集荧光信号后失活至暗态，重复此过程直至样品中的荧光信号均被采集，然后将采集的荧光信号进行高斯拟合，计 算出每个荧光信号的中心坐标位置，将全部坐标位置信息重构出样品的结构，形成高分辨率图像。

因此，应用STORM显微成像技术获得的图像是通过高斯拟合形成的重构图像，而不是 样本的真实图像[22]。

1.2.2STORM显微成像技术的生物医学应用
STORM显微成像技术在生物医学中主要应用于细胞器、蛋白质、染色质等的定位，不仅推 动了神经科学的研究进展，也为探究染色质的超微结构提供了技术支持。

STORM显微成像技术对亚细胞结构观察的应用较为成熟。

利用STORM显微成像技术对细胞膜结构进行成像，可以观察到细胞外囊泡与细胞膜的相互作用，而细胞内的囊泡与溶酶体共定位[23]。

通过对嘌呤体和线粒体的共定位，揭示哺乳动物雷帕霉素耙蛋白（mammalian target of rapamycin，niTOR )影响嘌呤体组装进而调控核苷酸代谢的机制[24]。

STORM显微成像技术结合延时成像技术可观察线粒体的裂变与融合过程，内质网的重构以及神经突触在信号传递中膜的不均匀扩散现象[25]。

STORM显微成像技术的应用推动了神经科学领域的研究进展。

Sigal等[26]搭建了 STROM 显微成像技术与连续超薄切片技术相结合的平台，采用连续自动采集和自动合成的分析技术，绘制出神经节细胞突触的图像，揭示了神经网络中突触的信息传递方式。

Schedin - Weiss 等[27]在对阿尔茨海默症患者的神经突触研究中进一步锚定神经突触中跨膜蛋白7-分泌酶的位置，结果表明7-分泌酶广泛存在于突触前膜和突触后膜[27]。

X u等[28]应用三维STORM 显微成像技术对神经细胞中膜相关周期性骨架蛋白的分布与结构进行研究，解析了神经轴突中蛋白的分布，其中肌动蛋白和成帽蛋白形成均匀分布的环状结构，相邻的环状结构由血影收缩蛋白连接，形成间距为180 n m ~ 190 n m 的周期性分布。

在染色质结构的研究中，S T O R M显微成像技术最早应用于单链D N A分子的结构解析[3]。

通过对S T O R M显微成像技术的优化与应用，Beliveau等[29]对单拷贝基因组进行了可视化成像。

1^批11等[3°]则进一步建立了一个具有自动分割、多色标记功能的S T O R M显微成像平台，将染色质目标基因组区域划分为41个片段，每 个片段30 k b，进行多色超高分辨成像和定量分析研究，获得单细胞染色质的超微结构。

M a t e o等[31]结合S T O R M显微成像技术和O R C A (optical reconstruction of chromatin architecture)技术，将染色质D N A检测的分辨率提高到2 k b，清晰地展示了增强子和启动子的相互作用对基因转录的影响。

2 S T E D与S T O R M显微成像技术比较分析
2. 1成像时间及分辨率
S T E D显微成像技术的成像时间优势较强，一般只需几秒钟即可完成图像采集。

S T E D显 微成像技术可以观察分辨率小于100 n m的结 构。

S T E D显微镜下动物大脑切片和小鼠大脑神经元成像分辨率可达到60 n m ~ 80 m n[32_33]。

S T O R M显微成像技术的图像是逐点重建生成的，需要进行十万至千万个图像定点检测，经过软件处理重建出超高分辨率图像[34]。

因此，S T O R M显微成像技术的成像时长受采集图像定点数量和软件重建速度的双重制约，通常 获得一张单色S T O R M图像需要15 ~ 30分钟，获得多色图像耗时更长[35]。

S T O R M显微成像技术更适用于对图像分辨率要求较高的实验。

应用S T O R M显微成像技术获得的神经细胞中肌动蛋白和血影收缩蛋白结构的图像分辨率可达到横向小于10 n m,纵向小于20 n m'28」〇S T O R M显微成像技术的空间分辨率与探针大小、荧光强度和标记的密度相关，荧光亮度越强、定点数量越多，最终重建的图像分辨率也会越高，但过高的光强度和过多的定点会对观测样本造成损伤[36]。

2.2 荧光探针的选择
S T E D显微成像技术通常采用激发光能量
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较低且背景干扰较小的罗丹明类荧光染料。

最 具代表性的荧光染料是A T T0647N,此种染料消光系数较大且量子效率较高。

另一种常用的荧光染料K K1 14,水溶性和光稳定性较好，但 细胞渗透性和N-羟基琥珀酰亚胺酯稳定性较低。

综合两种焚光染料的优势，W u r m制造出具 有较高量子效率同时N-羟基琥珀酰亚胺酯稳定的新型染料，并成功应用于S T E D显微成像技术[37]。

因成像要求和样本性质不同，S T O R M显微 成像技术主要采用具有光控开关性质的花青素类染料和罗丹明类染料。

花青素类染料在荧光态具有较高的光子发射效率，能够在20 n m的空间分辨率下识别单个分子[38]。

罗丹明类染料具有较高的膜渗透性，可用于活细胞中R N A 的超分辨率成像[39]。

3 超高分辨率显微成像技术的局限性
尽管超高分辨率显微成像技术已经广泛应用于生物医学研究领域，其应用仍然存在局限性。

S T E D显微成像技术成像时所需荧光强度较高，易导致光的漂白性[33]。

S T O R M显微成像技术虽然成像所需荧光强度较低，但需采集大量图像，耗费时间较多[4〇]，图像的真实性对算法的依赖度较高[41]。

此外，超高分辨率显微成像技术在活体样本中的进一步应用受到探针和激发光的光毒性限制。

活体样本成像时需要用强激发光活化荧光探针，被激活的荧光探针发出的光子及强激发光会产生光毒性，导致细胞活性下降甚至凋亡。

而更高的空间分辨率需求，导致荧光探针发出更多光子，带来更严重的光毒性。

因此，探针的光毒性和激发光的光毒性限制了超高分辨率显微成像技术对活细胞的长时间连续成像。

4 展望
S T E D与S T O R M是基于不同策略的两种超高分辨率显微成像技术，现已成为生物医学领域重要的研究工具。

展望未来，超高分辨率显微成像技术的发展趋势应该满足生物医学成像中三维、活体及快速成像的需求，获得更高的空间分辨率和更快的时间分辨率。

因此，超高分辨率显微成像技术应从以下几个方面进行优化：①发展新的超高分辨率硬件，更高输出功率的激光器、更快的扫描元件、更低光损耗的光学组件、更快更灵敏的单光子探测器、更智 能的自适应光学系统；②开发和优化新的探针及标记方法，对荧光探针和染料做结构分析及改造，提高光稳定性、亮度、光激活、光转化、光 开关等特性，提高探针标记的特异性、降低非特异性；③开发新的数据处理算法，以满足三维大尺度层面（如整个神经元）以及四维基因组成像的需求。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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(收稿日期：2020-07-05)。