猪圆环病毒2型江西株的全基因组克隆和序列分析

猪圆环病毒2型江西株的全基因组克隆和序列分析
蔡高峰;李凯;张黎;王伟松;何后军
【摘要】为了解江西地区猪圆环病毒2型(PCV-2)的流行和进化情况,根据GenBank上已发表的PCV-2全基因序列设计1对引物,PCR扩增后得到9条PCV-2全基因序列,并对其全基因序列核苷酸和蛋白序列进行分析,绘制遗传进化树.结果表明,江西地区流行的9株PCV-2中,基因组序列全长分为8株1 767 bp和1株1 768 bp,9株PCV-2的核苷酸同源性为94.7%~99.9%,与GenBank己发表的PCV-2分离株全基因组同源性介于94.3%~99.8%之间,而9株PCV-2的ORF1核苷酸序列同源性为96.9%~100.0%.ORF2和ORF3编码的蛋白氨基酸序列存在部分位点突变.遗传进化树显示为3种基因型:5株PCV-2b、3株PCV-2d、1株PCV-2a.本研究有助于江西地区PCV-2的监测和防制.%In order to understand the epidemiology and evolution of PCV-2 in Jiangxi province, a pair of primers was designed according to the PCV-2 gene sequence published in GenBank.After PCR amplification, we got the whole genome sequence of 9 strains PCV-2 isolates, and the nucleotide and protein sequences were analyzed, the genetic evolutionary tree was constructed.The results showed that the complete genome of 8 out of the 9 strains were 1 767 bp in length and one strain was 1 768 bp.By analyzing the whole genome sequences of the nucleotide,the homology of nucleotide sequences of the 9 strains was 94.7% to 99.9%.Compared with other whole genome sequences of PCV-2 in GenBank, the homology was 94.3% to 99.8%.The homology of nucleotide sequences of the ORF1 of the 9 strain was 96.9% to 100.0%.ORF2 and ORF3 encoding protein amino acid sequence had
some locus mutation.Phylogenetic tree analysis showed that the 9 strains could be divided into 3 genotypes,5 strains belonged to PCV-2b, 3 strains belonged to PCV-2d, and 1 strain belonged to PCV-2a.This study was helpful to monitor and control of PCV-2 in Jiangxi province.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2017(044)003
【总页数】9页(P790-798)
【关键词】猪圆环病毒2型;全基因组;序列分析
【作者】蔡高峰;李凯;张黎;王伟松;何后军
【作者单位】江西农业大学动物科学技术学院,南昌 330045;江西农业大学动物科
学技术学院,南昌 330045;江西农业大学动物科学技术学院,南昌 330045;江西农业大学动物科学技术学院,南昌 330045;江西农业大学动物科学技术学院,南昌330045
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
1974年，德国研究者Tischer等发现，在猪肾细胞（PK15）中有一种圆形小颗粒病毒，该病毒形态上类似于小RNA病毒，能持续感染PK15细胞，但不引起细胞病变。

1982年，应用超速离心的方法获得了病毒粒子及病毒核酸，通过电镜观察，发现这种圆形小颗粒病毒实际上是单链环状的DNA病毒，首次将其命名为猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）［12］。

PCV是一种小DNA病毒，平均直径只有17nm，无囊膜包被［3］。

PCV基因组长度约1．7kb，是独特的、单股共
价闭合环状的DNA。

PCV在分类上属于圆环病毒科［4］。

PCV在外界的生存能
力较强，能在pH 3的酸性环境中及氯仿中长时间存活，在70℃时可存活15min，病毒不能凝集猪、牛、羊、鸡等动物和人的红细胞。

根据PCV的致病性、抗原性
和基因序列可将其分为2种血清型PCV－1、PCV－2，其中PCV－1没有致病性，PCV－2有强致病性［5］。

PCV－2的全基因长度为1 767或1 768bp，对猪有
很强感染性，可通过口腔、呼吸道等途径感染不同年龄的猪［6］。

研究表明，PCV－2可能含有11个开放性阅读框（open reading frame，ORF）。

ORFs之间有较大的差异，其中ORF1、ORF2和ORF3是主要开放阅读框，ORF1由945个核苷酸组成，编码与病毒复制相关的必需蛋白（Rep蛋白）［78］；ORF2由702或705个核苷酸组成［9］，位于PCV－2基因组负链上，编码病毒的主要结构蛋白和免疫蛋白（Cap蛋白）；ORF3与病毒的致病性相关，由315个核苷酸
组成，编码诱导细胞凋亡的相关蛋白［1011］。

PCV－2感染后主要可引发猪断奶后多系统衰弱综合征（PMWS）、皮炎与肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性间质性肺炎、繁殖障碍［12］。

PCV－2主要感染6～12周龄的仔猪，病猪会出现渐进性消瘦、贫血、呼吸道症状、黄疸和淋巴系
统疾病，剖解能观察到淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液脓性支气管炎、间质性肺炎［1314］。

病猪的死亡率高达50%左右，康复猪也会成为僵猪，PCV－2经常
和细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染，造成猪免疫机能下降、生产性能降低，给养猪业带来巨大的经济损失。

PCV－2基因组比较稳定，但也存在着变异的可能性。

本试验对江西地区分离到的PCV－2毒株进行测序分析，也与国外毒株的核苷酸进行了同源性分析，为江西地区PCV的流行病学调查
和制定防制措施提供了理论依据。

1．1 材料
江西省9个地区不同猪场采集9份样品，保存在－80℃冰箱中。

限制性内切酶
KpnⅠ和PstⅠ、pMD18－T载体、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶、
DL2000DNA Marker和Agarose Gel DNA Purification Kit均购自大连宝生物
工程有限公司；TOP－10感受态细胞、TIAN prep Mini Plasmid Kit均购自北京天根生物有限公司。

1．2 方法
1．2．1 病毒DNA的提取取病料放入1．5mL EP管中，加生理盐水，进行匀浆，放入离心机以8 000r／min，离心5min，取上清400μL放入1．5mL EP管中，加500μL细胞裂解液，37℃放置45min，加入500μL平衡酚，混匀后放置3min，以10 000r／min离心5min，取上清放入1．5mL EP管中，加入500μL氯仿／异戊醇混合液，混匀后以10 000r／min离心5min，取上清放入1．5mL EP管中，加入510μL无水乙醇／醋酸钠混合液，混匀后以10 000r／min离心3min，弃上清，用双蒸水溶解，放入－20℃保存备用。

1．2．2 PCV－2全基因序列的PCR扩增参考GenBank上公布的PCV－2序列（登录号：AY696004），利用生物软件Oligo 6辅助设计一对引物。

引物序列为：F：5′－TTTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT－3′；R：5′－AGCCCGCG GAAATTTCTGACAAACGTTACA－3′，预计扩增片段大小为1．7kb。

引物由武
汉生物工程技术公司合成。

PCR反应体系50μL：10×（Mg2＋）Buffer 5μL，dNTP（10mmol／L）1μL，MgCl2（25mmol／L）5μL，上、下游引物（20pmol／μL）各1μL，模板DNA 4μL，Taq DNA聚合酶（5U／μL）0．5μL，ddH2O 32．5μL。

加完样后，将PCR管放入离心机中，瞬时离心。

然后放入PCR仪中扩增，程序如下：95℃预变性5min；94℃变性60s，59℃退火60s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物经1．0%琼脂糖凝胶电泳分析并拍照。

1．2．3 PCV－2全基因的克隆 PCR产物用胶回收试剂盒进行胶回收并纯化，然
后用pMD18－T载体4℃过夜连接，转化TOP－10感受态细胞，挑选克隆菌落
扩增培养，提取质粒，采用PCR扩增和质粒酶切进行阳性转化子的筛选和鉴定。

重组菌液鉴定为阳性后，送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，其结果用DNAStar软件进行分析。

1．2．4 PCV－2全基因组测序分析将鉴定含有重组质粒的菌液送至上海生物工
程技术服务公司测序。

测序结果用NCBI－BLAST、Mega 5．0等软件拼接后比
对分析，与GenBank中25株PCV－2地方序列和4株亚型参考株（AY181946，EU148503，AB426905，AF055394）进行比对，参考毒株序列见表1。

用Clustal X进行PCV－2全基因组序列比对，使用Boot－strapped Neighbor－Joining算法生成系统进化树；PCV－2全基因组，PCV－2的ORF1核苷酸序列，ORF2和ORF3氨基酸序列用DNAStar软件进行同源性分析。

2．1 PCV－2全基因序列临床样品的PCR扩增
江西地区患猪中提取的DNA模板，经F／R引物进行PCV－2全基因序列扩增后，其产物用1．0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。

由图1可知，扩增片段与预
期大小相符，约为1 700bp。

2．2 江西地区PCV－2全基因组同源性分析
测序结果显示，江西地区9株PCV－2全基因组中除了赣州分离株全基因组大小
为1 768bp，其余全基因组大小均为1 767bp。

比较9株PCV－2全基因组核苷
酸序列同源性，9株全基因组核苷酸之间同源性为94．7%～99．9%，其中同源
性最低的是赣州株（GZ－JX－CN）与抚州株（FZ－JX－CN）；同源性最高的是九江株（JJ－JX－CN）与高安株（GA－JX－CN）；与国内外参考毒株比较发现，赣州株（GZ－JX－CN）与丹麦株（EU148503）同源性最低（94．3%）；高安
株（GA－JXXN）、九江株（JJ－JX－XN）、新建株（XJ－JX－XN）与英国株（AF055394）同源性最高（99．8%）（图2）。

2．3 江西地区PCV－2全基因组的遗传进化树分析
应用Mage 5．0分析软件通过Boot－strapped Neighbor－Joining方法比较9株江西分离株全基因组序列与已发表的25株PCV－2地方参考株全基因组序列和4株PCV－2亚型参考株全基因组序列，绘制遗传进化树，结果见图3。

由图3可知，PCV－2的一个大分支南昌株（NC－JX－CN）、高安株（GA－JX－CN）、宜春株（YC－JX－CN）、九江株（JJ－JX－CN）和新建株（XJJX－CN）与4株江西参考株（AY732494，HM776445，HM776446和EF493837）、广东株（AY916791）、华南株（EF421973）、广西株（AY556475）、福建株
（DQ180393）、浙江株（AY691169）、法国株（AY322000）、香港株
（DQ997817）、韩国株（EU450592）、英国株（AY484413），德国株
（AF201897）和PCV－2b亚型参考株（AF055394）同属于PCV－2b亚型，且全基因组大小均为1 767bp。

PCV－2的另一个大分支由其他分离株及参考株组成，其中抚州株（FZ－JX－CN）、吉安株（JA－JX－CN）和上饶株（SR－JX－CN）与PCV－2d亚型参考株（AY181946）同属于PCV－2d亚型，全基因组大小均
为1 767bp。

PCV－2a亚型有台湾株（AF364094）与2株新疆株（GU370063
和 GU370064）、赣州株（GZ－JX－CN）、南非株（AY325495）、美国株（AJ223185）和PCV－2a亚型（AB426905）参考株，全基因组大小均为1
768bp。

PCV－2c亚型有2株丹麦株（EU148504和EU148505）和PCV－2c
亚型参考株（EU148503），全基因组大小均为1 767bp。

2．4 江西地区PCV－2分离株ORF1核苷酸序列及ORF2、ORF3编码的氨基酸
序列分析
用DNAStar对PCV－2江西株和5株参考株（HM776445、AF055394、
AY181946、AB426905和EU148503）的ORF1核苷酸序列及ORF2、ORF3编码的氨基酸序列进行比较分析，结果见图4～6。

由图4可知，9株PCV－2江西
毒株ORF1核苷酸序列同源性为96．9%～100．0%。

由图5可知，Cap蛋白氨基酸序列的主要变异位点在25－87和114－182氨基
酸处，其中变异比较明显的是与PCV－2a亚型参考株（AB426905）同源率较高
的赣州株（GZ－JX－CN）。

在Cap蛋白中有：A（57－91）、B（121－137）、C（183－191）、D（206－215）和E（230－233）5个主要的抗原表位区［15］，在A（58－59、64－68、72、75、87）和B（125）处9株PCV－2
江西分离株Cap蛋白存在明显的变异；在Cap蛋白核定位信号区［15］并没发生变异；在Cap蛋白的其余区域的氨基酸序列也都表现出保守性（特别是南昌株和
高安株）。

由图6可知，3位氨基酸是PCV－2江西株ORF3蛋白主要变异位点，其中变异
较大的是赣州株（GZJX－CN），在3、10和16位氨基酸处均有变异；南昌株（NC－JX－CN）仅在81位氨基酸处有变异，宜春株（YCJX－CN）仅在98位
氨基酸处有变异。

本试验通过采集江西九江、高安、新建、宜春、南昌、吉安、抚州、上饶、赣州9个地方的发病猪组织进行PCV－2DNA的提取，并对其全基因组进行分析。

从本次对江西地区PCV－2全基因序列的研究分析可知，江西省流行PCV－2b、PCV－2d、PCV－2a3种亚型，以PCV－2b、PCV－2d为主，全基因大小为1 767bp，PCV－2a的全基因大小为1 768bp。

九江株（JJ－JX－CN）、高安株（GA－JX－CN）、新建株（XJJX－CN）、宜春株（YC－JX－CN）、南昌株（NC－JX－CN）5株江西分离株与江西参考株同属于PCV－2b亚型，同源性也
较高，可以推断PCV－2在进化上具有一定的保守性。

吉安株（JA－JX－CN）、抚州株（FZJX－CN）和上饶株（SR－JX－CN）3株江西分离株与PCV－2d亚型同属于1个亚分支，赣州株（GZ－JXCN）与PCV－2a亚型同属于1个亚分支。

江西株之间同源性并不高，遗传进化不稳定，各地方的差异较大，从中可以看出江
西地区可能存在着以PCV－2b亚型为优势基因型的多种基因亚型一同流行的趋势。

江西分离株与欧洲病毒株同源性相近，造成这一结果的原因可能是江西疫病防制水平低，与欧洲国家有种猪交流所致。

同时本研究发现，PCV－2江西株的来源不一致，推测可能是由于各地区间水平传播所造成。

进化树分析结果表明，江西分离株主要与2004～2008年的地方分离株进化关系接近，而与2000～2003年的地方
分离株进化关系较远。

可以推测在2003～2004年之间，江西地区的PCV－2可
能发生了变异。

9株江西PCV－2的ORF1核苷酸序列的同源性较高，由于ORF1主要编码病毒复制的相关蛋白，所以可以推测出江西地区PCV－2的进化具有相
对稳定性。

由ORF2编码的Cap蛋白与PCV－2的致病性有关，其变异可能导致新的变异毒
株出现［16］。

在Cap蛋白的主要抗原表位上，PCV－2江西分离株有一定程度
的变异。

这可能会使今后江西地区的PCV－2的致病性和免疫原性发生改变［17］。

PCV－2的主要致病机理是引起患猪淋巴细胞和组织细胞的凋亡［18］。

而在PCV－2感染过程中，ORF3编码的蛋白会控制细胞凋亡，其主要是通过与pPirh2反应或是干扰p53与pPirh2的连接来完成的［19］；有相关研究表明ORF3蛋
白与PCV－2的致病性有关，ORF3蛋白的缺失或变异能减弱PCV－2的致病力［20］。

本研究结果发现在ORF3蛋白3位氨基酸处发生突变，与ORF3蛋白（特别是其中前50个氨基酸）在猪感染PCV－2中起着十分重要的作用相吻合［21］。

PCV－2江西株ORF3编码的蛋白变异较小，主要在9、12、33、51、195和231等处有变异，这可能会干扰ORF3编码的相关蛋白的翻译，使蛋白的
二级结构发生改变，从而改变PCV－2的致病力。

江西地区流行的9株PCV－2中，基因组序列全长分为8株1 767bp和1株1 768bp。

9株PCV－2的同源性为94．7%～99．9%，与GenBank已发表的
PCV－2分离株全基因组同源性介于94．3%～99．8%之间。

9株PCV－2的ORF1核苷酸序列同源性为96．9%～100．0%。

ORF2和ORF3编码的氨基酸序列存在部分位点突变。

遗传进化树显示为3种基因型：5株PCV－2b、3株PCV －2d、1株PCV－2a。

本研究为江西地区PCV－2的防制措施的制定和流行病学研究提供了理论依据。

【相关文献】
［1］尹业师，黄伟坚，陈琼，等．猪圆环病毒感染的病理组织学和致病机理研究进展［J］．动
物医学进展，2006，27（11）：18－21．
［2］周松海．猪圆环病毒2型捕获ELISA抗体检测方法的建立与临床应用［D］．武汉：华中农业大学，2013．
［3］乔翠，高凤山，许崇波．猪圆环病毒2型分子致病机理及相关疾病研究进展［J］．中国畜
牧兽医，2012，39（2）：170－173．
［4］温立斌．猪圆环病毒2型的分子流行病学研究［D］．北京：中国农业大学，2005．
［5］ Allan G，Meehan B，Todd D，et al．Novel porcine circovirus from pigs with wasting disease syndrome［J］．Vet Rec，1998，142（17）：476－478．
［6］张志，孙启峰，张美晶，等．我国猪圆环病毒病的流行病学分析［J］．中国动物检疫，2015，32（11）：6－10．
［7］郭颖初，王开功，周碧君，等．猪圆环病毒2型ORF1基因的克隆与原核表达［J］．中国
畜牧兽医，2013，40（11）：30－33．
［8］王生育，颜江华，孔繁德，等．猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达［J］．中国预防兽医学报，2007，29（12）：934－937．
［9］董烨，郭士琪，孙雪，等．辽宁地区猪圆环病毒2型全基因克隆与序列分析［J］．中国畜牧兽医，2015，42（11）：2895－2901．
［10］王伟丞，曾智勇，汤德元，等．猪圆环病毒2型贵州株全基因组的克隆与序列分析［J］．畜牧与兽医，2014，46（9）：90－93．
［11］孙贤．猪圆环病毒2型的流行病学调查与综合防控措施研究［D］．南京：南京农业大学，2012．
［12］刘金鑫，孙孟娇，陈磊，等．猪圆环病毒研究进展［J］．动物医学进展，2012，33（2）：94－97．
［13］陈琼．猪圆环病毒2型福建株的全基因组克隆与序列分析［J］．生物技术通报，2010，2：194－198．
［14］朱向波．猪圆环病毒2型研究进展［J］．中国畜牧兽医文摘，2015，31（4）：135－136．
［15］ Make D，Blanchard P，Truong C，et al．Diferential recognition of ORF2protein from typel and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes ［J］．J Gen Viro1，2000，81（7）：1815－1824．
［16］ Stevenson L S，Gilpin D F，Douglas A，et al．T lymphocyte epitope mapping of porcine circovirus type 2［J］．Virat Immunol，2007，20（3）：389－398．
［17］李海花，覃尧，张全红，等．猪圆环病毒2型Cap全基因的克隆与原核表达［J］．中国
畜牧兽医，2015， 42（2）：337－341．
［18］ Kiupel M，Stevenson G W，Galbreath E J，et al．Porcine circovirus type 2（PCV2）causes apoptosis in experimentally inoculated BALB／c mice［J］．BMC Vet Res，2005，
1（1）：1－8．
［19］ Liu J，Zhu Y，Chen I，et al．ORF3protein of porcine circovirus type 2interacts
with porcine ubiquitin E3 ligase Pirh2and facilitates p53expression in viral infection ［J］．J Virol，2007，81（17）：9560－9567．
［20］杨晓农，郭万柱，徐志文，等．猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性
及免疫原性研究［J］．畜牧兽医学报，2008，39（8）：1094－1099．
［21］ Timmusk S，Wallgren P，Brunborg I M，et al．Phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2（PCV2）pre－and post－epizootic postweaning multisystemic wasting syndrome（PMWS）［J］．Virus Genes，2008，36（3）：509－520．。