一种快捷有效的构建cDNA文库的方法

一种快捷有效的构建cDNA文库的方法
贵州科学27(3):71-75,2009
Guizhou Science
一种快捷有效的构建cDNA文库的方法
徐远峰1 黄文峰2 高艳梅1 翟金玲1 黄惜1
(1海南大学农学院生物科学技术研究所,海南海口570228;2中国热带农业科学院橡胶栽培研究所,海南儋州571737)
摘要构建c DNA文库是研究基因组功能基因一种有效的手段,传统的建库方法通常需要在双链c DNA两端分别加上带限制性酶切位点的接头序列,通过酶切使之产生与质粒匹配的粘性末端,然后与质粒连接构成文库。

本文介绍一种简单而且不需要核酸内切酶的构建c DNA 文库的方法。

该方法的主要步骤包括:(1)通过反转录合成c DNA第一条链,通过置换底物的方式在c DNA3’末端合成接头序列。

(2)利用c DNA两端的接头引物,通过Taq DNA合成酶PCR扩增合成c DNA第二条链。

(3)将PCR产生的双链c DNA直接与T-载体连接。

(4)将连接物转化大肠杆菌,得到c DNA文库。

利用本方法,我们成功构建红树植物红海榄的c DNA文库。

PCR结果显示插入的片段分布在0.5～3.0kb之间,大部分c DNA的长度在500～1000bp 之间,表明c DNA具有较好的完整性。

本方法具有操作简单、高效率、低成本、RNA模板需要量少的特点,而且适用于任何高等生物RNA样品。

关键词红海榄,c DNA文库,T-载体
中图分类号O641.3 文献标识码 A 文章编号1003-6563(2009)03-0071-05
A Rap i d and Eff i c i en t M ethod for Con structi on of cD NA L i brary
XU Y UAN-feng1 HUANG W en-feng2 GAO Yan-m e i1 ZHA I J i n-li n g1 HUANG X i1
(1Institute of B iolog ical S cience and Technology,Ha inan U niversity,Haikou570228,China;2Institute of R ubber Tree Culture,Chinese A cade m y of Tropical A gricultu ral S cience,D anzhou571737,China)
Abstract:Constructi on of c DNA library is an efficient t ool t o study functi onal genes in genom ic width.The tradi2 ti onal method of constructi on of c DNA library requires adding adap t ors t o each end of c DNA,which p r ovides a s pe2 cific site for restricti on nuclease.I n this work,a rap id and efficient method is intr oduced,which does not required restricti on nuclease and DNA ligase.This method includes the foll owing p r ocesses:(1)first strand of c DNA was synthesed thr ough reverse transcri p ti on,meanwhile,adap t ors were added t o both end of c DNA;(2)the second strand of c DNA was synthesed by PCR using Taq poly merase,t w o adap t or sequences served as p ri m ers;(3)ds c DNA were directly ligated int o T-vect ors;(4)the ligated vect ors were transf or med int o E.coli and generated a c DNA library.By this method,c DNA library of Rhiz ophora styl osa was constructed.PCR showed that the frag ment length of c DNA library ranged fr om500bp t o3kb and the lengths of the most insertswere500-1000bp,indicating that the library is highly qualified.The method shown in this work is in si m p le operati on,high efficiency,l ow cost, and less RNA te mp late.Additi onally,it is suitable f or all kinds of eukaryotic RNA sa mp les.
Key words:R hizopora stylosa,c DNA library,T-vect or
收稿日期:2008-10-12
基金项目:海南省教育厅高校科研指导性项目(H j2008-09),热带作物栽培生理学重点开放实验室开放课题基金项目(K LOF0602)和海南省耐盐作物生物技术重点实验室开放基金项目资助(shkfjj0521)。

作者简介:徐远峰(1983-),广西梧州人,硕士研究生,主要从事作物耐
盐基因研究;通讯作者(同等贡献作者):黄惜(1969-),博士,研究员,从事植物逆境生理研究,Tel:0898-********,E-mail:xihuang01@g 。

同等贡献作者:黄文峰。

1970年,反转录酶被发现可以在体外以mRNA 为模板合成c DNA[1],1975年,Rougeon等人第一次成功地构建c DNA文库[2]。

此后,克隆c DNA的方法不断得到改进和完善[3,4],构建c DNA文库成为一种鉴定未知生物基因组功能基因的有效手段[5]。

c DNA文库的构建方法也日渐成熟,常见的构建c DNA文库的商品化试剂盒有Cl ontech S MART L ibrary Constructi on Kit,TaKaRa c DNA L ibrary Con2 structi on Kit,Stratagene La mbda Z APa II和Z AP Ex2 p ressa系统等。

各种构建文库的方法尽管不尽相同,但主要的技术手段不外乎包括:采用polyd(T)寡聚糖核苷酸与mRNA的poly(A)互补配对为引物,以mRNA为模板通过RNA反转录酶催化合成第一条c DNA链。

然后通过DNA聚合酶合成第二条c DNA链。

为了将合成的c DNA克隆到载体中,需要在双链c DNA两端加上两个带有特异酶切位点的接头引物,另外,为了在酶切接头引物时不至于将c DNA切断,还必须将所合成的c DNA甲基化。

切割完成后连接到载体中,最后通过转化得到c D2 NA 文库。

这些方法都涉及到接头引物和酶切等复杂程序,操作太繁琐,造成一次成功的可能性降低,更不能轻易采用对微量宝贵样品建库。

此外,构建文库的试剂盒都非常昂贵,对于经费比较缺少的实验室也是问题。

最近有人采用噬菌体插入/切除位点特异性重组系统(即G ATE WAY T M 系统)将c DNA 重组到载体中,从而避免接头与酶切(专利号: 200410000681.8),但位点特异性重组的效率是有待提高的,而且用于重组的Cl onase R酶也相当昂贵,在推广上有一定难度。

本文介绍一种既简单经济,又快速高效,既不需要大量RNA样品,又能高通量、高成功率的构建c DNA文库的方法。

采用该方法构建c DNA文库既不需要核酸内切酶,也不需要噬菌体插入/切除位点特异性重组系统。

红树植物由于常年生长在海边,具有很强的耐盐耐涝能力,其组织内的内含物如多糖和蛋白会特别丰富,提取红树RNA比较困难,构建这种植物高质量c DNA文库难度较大。

本文我们就以红树植物红海榄(R h
izophora stylosa)为例,来验证这种构建c DNA文库新方法的可靠性。

1 材料和方法
1.1 材料
从海南东寨港红树林保护区选取成熟的红海榄种子(母树上胎萌的小苗),在含3%NaC L的液体MS培养基中栽种。

大约1个月后,收集红树新萌发的根,立即用液氮速冻研磨,分装后放在-80℃冰箱保存。

反转录酶SuperScri p t II购自I nvitr ogen公司,T -载体为pMD-20T-载体(TaKaRa)。

2 方法
2.1 提取红树和橡胶总RNA
红树RNA的提取是在CT AB法[6]的基础上进行了改进,植物材料经液氮速冻和研磨后,取5g材料粉末加入到20m l CT AB抽提液中(2%CT AB;100 mMTris pH8.0;20mM E DT A;1.4M NaCl;2% mecap t ol ethanol),65℃水浴1h。

然后在13000r pm 下离心1h,在上清液中加入16m l乙醇和0.4m l Na AC(3M,pH5.2),-20℃沉淀2h。

然后在13000 r pm离心30m in,弃上清,加3m l TE溶解沉淀物,再加1m l L i Cl(8M),4℃过夜沉淀。

13000r pm离心30m,弃去上清液,沉淀物溶于650μl TE,再加入650μl苯酚,10m冰上冷藏,14000r pm离心10m;上清液中加入500μl氯仿,冰藏10m in,14000r pm离心10m in。

移出上清液并加入2倍体积的乙醇和30μl Na Ac(3M,pH5.2),-20℃沉淀2h。

13000r pm离心30m in,弃去上清夜。

用1m l70%乙醇洗涤沉淀物,快速离心1m in,弃去乙醇,沉淀物溶于45μl双蒸水中。

最后进行浓度测定和甲醛琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量。

2.2 构建cDNA文库的方法
本文介绍的c DNA文库的构建方法如图1所示,由以下步骤组成:
2.2.1 c DNA第一条链的合成
将3μl红树RNA样品(大约1.0μg总RNA)与Seq I D No.1(AAG C AGTGGT AT C AACG C AG AGTGG C2 C ATT ACGG CCGGG)和Seq I D No.2ATT CT AG AGG C2 CG AGG CGG CCG AC ATG(T)30VN各1μl在无菌离心管中混合,然后72℃温浴2m in,然后放
置冰上2m in。

然后分别加入2.0μl5X第一条链缓冲液;1.0μl DTT(20m M);1.0μl d NTP M ix(10m M);1.0μl Su2 perScri p t II反转录酶。

然后42℃空气温浴60m in。

反应时间完成后,将离心管放在冰上终止反应。

2.2.2 通过PCR合成c DNA第二条链
在离心管中分别加入2μl单链c DNA,10μl 10X P CR缓冲液,2μl dNTP(10mM),引物SEQ I D
27贵州科学 27卷
No.1和引物SE Q I D No.2各2μl,最后加入TaKaRa LD Taq Poly merase2μl,然后进行在PCR仪(Perkin El m er,Gene Amp9600)上PCR反应。

反应程序为95℃1m in变性,然后95℃5sec,68℃6m in进行2个循环。

2.2.3 双链c DNA与T-载体的连接
将PCR产物经异丙醇沉淀和75%乙醇漂洗,晾干后溶于10μl水,之后加入5μl pMD-20T-载体(TaKaRa),3μl T4DNA连接酶和2μl T4DNA 连接酶缓冲液,混合后在16℃过夜连接。

2.2.4 大肠杆菌转化
20μl连接物和200μl电击感受态大肠杆菌混合,然后进行电击转化,取1μl在含氨苄霉素、X-gal和I PTG的LB平板培养基上进行涂布筛选,通过蓝白斑可以确定正确的转化菌斑,通过菌落PCR 检测的方法可以鉴定插入片段的大小。

3 结果与讨论
3.1 红树RNA的提取
由于红海榄的根部含有大量多糖、蛋白质和其它内含物,这些内含物会严重影响RNA的提取,本文使用改良的CT AB法提取红树RNA。

改进的CT AB法可以得到高质量的RNA,改进步骤主要包括:(1)利用乙醇和L i Cl交替沉淀RNA;(2)增加苯酚氯仿抽提步骤。

从提取效果看,用改进后的方法提取红海榄RNA的条带更加清晰,RNA降解减少,明显提高RNA的质量。

图1 利用T-载体构建cDNA文库的技术路线图
F i g.1 Te chno l o gy r o adm ap o f co n s truc ti o n o f cDNA li b ra ry u s i ng T-vec t o r.
37 3期徐远峰,等:一种快捷有效的构建c DNA文库的方法
用改良CT AB 发提取总红树根部总RNA,经Eppendorf 核酸测定仪测定其紫外吸收值,OD 260/OD 280为1.98,甲醛琼脂糖凝胶电泳显示核糖体RNA 条带清晰,无扩散,说明RNA 完整,可以用
于构建文库(图2)。

凝胶上电泳,结果显示合成
的c DNA 最大长度大于2.0kb,表明合成的c DNA 质量较高(图3)。

图2 红海榄RNA 甲醛琼脂糖凝胶电泳图1:样品1;2:样品2,最亮2条RNA 带分别为28S
和18S 核糖体RNA
F i g.2 E l e c tr op ho re s is o f t o ta l RNA o f
R h i zop ho ra styl o sa o n f o r m a l dehyde -aga r o se ge
l 1:sam p l e 1;2:sam p l e 2,28S and 18S ri bo som a l RNA
a re i nd i ca ted by the
b ri gh te s t t w o band s o n ge l
1
图3 红海榄双链cDNA 琼脂糖凝胶电泳图M:DNA 1kb Marker (Fer mentas );其余2条泳道
为5
μl 双链c DNA 样品。

F i g.3 E l e c tr op ho re s is o f
do ub l e -s tra nd cDNA o f R h i zop ho ra styl o sa M :DNA 1kb M a rke r (Fe r m e n ta s );the o the r t w o l ane s a re l o aded w ith 5μl d s -cDNA sam p l e
s
图4 红海榄cDNA 文库的PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳结果
M:DNA 1kb Marker (Fer mentas );1-78:78个红海榄c DNA 文库单菌落PCR 扩增片段。

F i g.4 PCR am p li fi ca ti o n and a ga r o se -ge l e l e c tr op ho re s is o f cDNA li b ra ry o f R h i zop ho ra s tyl o sa M :DNA 1kb M a rke r (Fe r m e n ta s );1-78:78PCR am p li co n s o f cDNA li b ra ry o f R h i zop ho ra styl o sa
3.2 文库的构建和检测
c DNA 文库质量的鉴定:将菌液稀释后测定文
库中原始滴度的结果显示,原始文库滴度为1.6×106pfu /mL 。

扩增后的c DNA 文库稀释105
,取出10μL 涂平板,计算扩增后的滴度为5.1×109
pfu /mL 。

从LB /Amp /x -gal/I PTG 琼脂平板上任意挑选78
个白色单菌落检测插入片段的大小,电泳结果显示插入的片段大部分在0.5～3.0kb 之间,大部分c DNA 的长度在500-1000bp 之间,表明c DNA 具
有较好的完整性(图4)。

实验证明,本方法构建c DNA 文库具有操
作简单、高效率、低成本、RNA 模
板需要量少等优点,而且适用于任何来源生物样
47贵州科学 27卷
品RNA。

本实验中c DNA反转录使用的MMLV反转录酶为RNase H-突变体(I nvitr ogen公司SuperScri p t Ⅱ),此酶能将更大部分的RNA转换成c DNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA 模板合成较长c DNA。

另外,Superscri p t II反转录酶具有完成mRNA 的反转录之后,在第一条c DNA链3’末端继续延伸3-5个胞嘧啶脱氧核苷酸特性。

利用此特点,设计一个5’接头引物Seq I D No.1,其3’末端为GGG,其余序列为任意一段特异性接头引物序列。

Superscri p t II反转录酶首先以Poly d(T)为引物(Seq I D No.2)合成c DNA,当合成的c DNA到达mRNA的5’末端后,将产生若干个C 的加尾,通过转换机制,继续以5’接头引物Seq I D No.1为模板继续合成,使c DNA第一条链3’末端接上接头,这样,合成的c DNA的3’和5’末端都分别加上Seq I D No.1和Seq I D No.2序列。

利用Taq DNA聚合酶,以Seq I D No.1和Seq I D No.2序列为引物,通过PCR合成c DNA的第二条链,利用Taq DNA聚合酶在DNA合成完成后的加尾特性,保证合成的双链c DNA2个末端均为A粘性末端,这样,双链DNA可以在T4-DNA连接酶作用下直接与带有2个T粘性末端的T-载体连接,之后通过转化完成c DNA文库的构建。

避免了在双链c DNA两端加接头和酶切的步骤,从而节省时间,提高效率。

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