肝硬化患者外周血miR-122、185的表达

HEILONGJIANG MEDICILE AND PHARMACY Feb.2027,Vod44No.1-175•肝硬化患者外周血mih-72、185的表达①
于俊洲，李卫明
（住木斯市传'病-，黑龙江住木斯152629）
摘要：目的：检测肝硬化早期血中微小RNA的表达。

方法：柱式提取全血小RNA,反转录合成微小RNA第一链cDNA（加尾法），根据miR-12、185成熟体序列设计特异引物，实时荧光定量PCR,根据循环阈值Ct值，用比较Ci法相对定量。

用化学放光免疫分析法检测血清中透明质酸（HA）和N型胶原（CIV）。

结果：肝硬化组全血miR- 722成熟体表达下降，而mih-15成熟体表达增加。

肝纤维化相关血清指标中，HA和cIV升高明显。

结论:HA和miRNA15有望作为肝硬化代偿期血液标志物。

关键词：肝纤维化;微小RNA；透明质酸
中图分类号:R277.2+7文献标识码：B文章编号：708-074（208）07-015-02
肝硬化是多种慢性肝病的重要临床结局。

代偿期无明显症状，一旦失代偿则以门脉高压和肝功能严重损害为特征,病人常因消化道出血、腹水、脓毒症、肝性脑病、肝肾综合征和癌变导致多脏器功能衰竭而死亡。

代偿失代偿病人5年生存率分别约59%和7%o代偿肝硬化和慢性肝炎的临床表现相似。

通常血常规、肝功71等现行的实验室检查难以鉴别。

B超、CT、核磁共振提示肝表面不光滑、脾厚，均非特异。

虽胃镜可知食道胃底静脉曲张，但是和肝穿刺活检一样存在风险，而且单个肝组织活检标本不一定能全面反映肝脏整体纤维化程度。

需要新的血液生物标志物来鉴别诊断。

基因理论是生物医学的重心。

人类大部分疾病都与基因异常有关。

微小核糖核酸是不编码蛋白质的RNA而参与转录后调控71，它与oRNA的短的互补序列结合，在转录产物的3UTR区，《卩非翻译区。

要么降解产物，要么抑制翻译过程，最终使靶蛋白降低，产生生理或病理效应。

目前,微小核糖核酸是很多疾病诊疗新的希望。

oiR-12是肝内特异表达的微小RNA,oiR-15是参与广泛病理过程的微小RNA,国内外对其做了部分研究，但是各家数据不一。

鉴于早期肝硬化的及时诊断意义，本院课题组拟对肝硬化的微小RNA作进一步研究。

1材料和方法
71主要仪器及试剂盒
实时荧光PCR仪（ABI7700）；全自动化学发光免疫分析仪（Mindray）。

oiRNA荧光定量PCR试剂盒（染料法7；柱式microRNA提取试剂盒;oiRNA第一链合成试剂盒（加尾法）O
1-2标本米集
随机选2215-7~2219-7佳木斯市传染病诊代偿硬48作为硬组,纳入标椎:符合2610年中华医学会代偿期肝硬化诊断依据（符合四条之一747组织学标椎；（2）内镜示消化道静脉曲张，除外非肝硬化门脉高压；（3）B 超或CT提示:脾大、门静脉内径^73co；肝脏硬度测定（LSM）符合诊断界值；（9）符合以下2条:①PLT<10x75/L；②血清白蛋白<35v/L；③IAR> 73或PT延长；④APRI评分>2。

另选取4、例确诊慢性肝炎患者（乙肝26，丙肝5,其他7）作为肝炎组;再选取体检中心健康体检者36例作为对照组;以上研究对象均空腹8h后抽取肘静脉血4管，其中2黄管取血清检测生化和肝纤维化等指标;；紫管查血常规;；红管立即送工作台抽提全部小RNA后,所得溶液置于-74°C保存。

78检测方法
化学放光免疫分析法检测血清中透明质酸（HA）和V型胶原（C V）等指标，常规检测生化、血常规。

物品去RNA酶处理，冰上操作。

Poly（A、加尾反应和cDNA合成同步进行，所得cDNA于4C冰箱保存。

冰上配20pl L反应体系，每个模板配4个;oiR -172-3P,oiR-72-5P,oiR-15-5P,U6（核内小RNA）o9体系上游引物不同，oiRNA12,75为成熟体引物（oiRBase）,U6为通用的U6内参的上游引物;下游引物共用;ROX染料校正液；DNA聚合酶;4种dNTP混合液;去RNA酶水等。

预变性99C O7S；变性99C,5S;退火/延伸，60C20S;变性退火/延伸共44个循环畐己录循环阈值Ct,用2-AA Ci计算比率做相对定量。

72统计学方法
采用SPSS17.2对数据分析，完全随机设计方差分析（单因素方差分析one way ANOV）,相关回归方法描述推断,P<0-09差异具有统计学意义。

2结果
汇总分析各组样本血液指标，前白蛋白、血小板、总胆红素、球蛋白、总胆汁酸、转氨酶等提示早期肝纤
①基金项目：黑龙江省卫健委科研课题，编号：221202o
作者简介:于俊洲（1799~7男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师o
通讯作者：李卫明（773-）男，黑龙江伊春人，硕士，主治医师o E-mail：2732973753@qq.cim 。

的向均不，未显示统计学意义。

对比正常组，肝炎组和肝硬化组HA、C V血清含高，全血oiR-177；■o OR-135；高。

组和肝硬化组比较,HA和C V无统计学意义。

oiR-17-3P、oiR-16-5P表达量差无统学。

硬化组合正常组比较,HA和C V有统计
学意义(P<0.09)；oiR-139-5P差异有统计学意义(P<0.05)。

见图1-3o
对比正常组、肝炎组，肝硬化组HA、C V血清含高，而且与oiR-15正相关，见图4~5o 相更。

02004006008001000
透明质酸血清含量
图4oiR-185与透明质酸相关分析
0.468
0200400600800
IV型胶原血清含量
图5oiR-185V与V型胶原相关分析
3讨论
基因调控是生物表型发生和生物学行为的中心环节71,近年发现的oiRNA揭的基达调，它在调“转录后或翻译初”修饰的基因起关键作用。

深入研究oiRNA及生命的71o血中的丰富的oiRNA作为方的诊7］。

oiRNA可以在组织和血液及其体液中出，对环境有公认的作用71O 微小核糖核常在体液裹外囊泡，例外泌体、微囊泡，释放于各类，用简法测
以作为生71O
基的联系是个性化的医学目的。

而的3UTR区与微小RNA密切联系71，影响生。

微小RNA是新发现的参与基：达的非编码RNA,存在核生物，其生物学特性是高度保守、时序和组特异性71，大约7 ~25个核昔酸，非常之短,传统的tezcd法提取长链RNA虽然可以，但是核昔酸的短链RNA得率，有的反还用oRNA盒,这样的短RNA反cDNA较困难。

用吸附柱抽提全部的RNA,合成cDNA时再加上polyA,用digo(dT))之配对,这反比，根据微小RNA的体序列设特异引物，最后PCR扩。

(HA)广泛存在外，主要在肝代谢,肝硬化病人由HA增加，而皮清除HA障碍，此二者导致血中HA升高,部分代偿硬化病人血中HA比血液更敏感，而且与血中oiR-139-5P的相关，说明二为早诊硬的生物物。

的不足是,病，比如需要，自身免疫性,吸虫病,3泉导致的的HA和微RNA的,还有oiR-17和oiR-185的靶需要进一步的研究。

(下转第72页
)
7结果
7.1两组患者的疗效分析
实验组患者的治疗有效率为07.20%(33/35),对照组的治疗有效率为74.27%(26/35)，两组治疗有效率差异存在统计学意义34=9.0591, P<0005。

7.2两组患者的临床指标分析
表、两组患者的临床指标比较(土s,d=35)组别中医证候积分(分)脾厚(mm)径(mm)实验组 4.22±、.2232.18±4.751712±746对组0.99±1.147.59±5.17.57±743
7.92747.3255607337
P<6.05<6.05<6.05
实验组患者治疗后中医证候积分为(9.27±792)分，脾脏厚度为(37.13±4.93)oo,门脉内径为(1717±729)mo,各项数据与对照组比较存在统计学意义(P<0.09)o
7.8两组患者的不良反应分析
实验组不良反应发生率为9.97%(2/35)，对照组的不良反应发生率为22.86%(8/35)，两组不良反应差异有统计学意义(2=4.3448,P<0.09)。

3讨论
肝硬化代偿期被中医理论归为“胁痛”和“积聚”范畴，该疾病的中医分型包括肝郁脾虚和湿热内蕴两种类型，同时兼具瘀血阻络和气阴虚损症状,贯穿于整个病程当中。

中医认为肝硬化代偿期肝郁脾虚夹瘀证发病后3'湿热”、''毒”进入患者经络,致使肝络受阻，进而产生了“瘀血”之证71o因而，在治疗上，需要着重于疏通受阻经络，达到疏肝理气的作用，同时祛瘀消肿，解除“瘀血”之证。

舒肝冲剂中，柴胡可以和解表里、疏肝升阳，白芍可以平抑肝阳、柔肝止痛，枳壳属于健胃剂、强壮剂，可以达到调理脾脏的作用，山楂具有活血化瘀的功效，茯苓可以利水消肿,莱服子具有消滞泻痢的功效,绿茶具有利尿解乏和消毒杀菌的功效，诸药合用可以达到疏肝理气、健脾消食和消肿止痛的作用71o安络化纤丸是由地黄、白术、三七、地龙、水蛭以及僵蚕等多种中药组成，具有软坚散结、健脾养肝以及凉血活血的功效。

两种药物联合西药治疗,可以显著改善肝硬化代偿期肝郁脾虚夹瘀证的临床症状，产生良好的治疗效果71o从本次研究结果来看:实验组患者的治疗有效率为99.27%(33/37)，对照组的治疗有效率为74.27%(26/35)，两组治疗有效率差异存在统计学意义(P<0.05)。

在联合中药治疗下，患者临床疗效有了显著提升，也就是说,舒肝冲剂和安络化纤丸对于肝硬化代偿期肝郁脾虚夹瘀证有着良好的治疗效果。

在治疗后,患者临床症状有了显著改善，脾脏厚度和门脉内径下降，也就是说，肝纤维化表现得到了缓解，水肿症状逐渐消退。

实验组不良反应发生率为9.97%(7/37)，对照组的不良反应发生率为22.86%(5/37)，两组不良反应差异有统计学意义(P<0.29)o在联合中药治疗下，患者的不良反应更少。

综上所述，舒肝冲剂联合安络化纤丸治疗肝硬化代偿期肝郁脾虚夹瘀证疗效显著，可以改善患者临床症状，促进肝功归转，同时不良反应较少，临床应用价值较高。

参考文献：
［11赵梓龙,吕靖.六味五灵片联合消臓利水方治疗乙型肝炎致失代偿期肝硬化肝郁脾虚证的临床研究7］1中医药信息,221,35
3)：77-81
［0］张建民.扶正化瘀胶囊治疗肝炎后肝硬化代偿期疗效观察及对患者生存质量的影响［J1中国基层医药2772138):2739-0741
7］贺延新，赵清喜,娄渊贵•异甘草酸镁联合熊去氧胆酸治疗自身免疫性肝炎肝硬化失代偿期的疗效观察71黑龙江医药科学, 2710,35(0)：11-10
7］杨沈秋，孙忠人，刘定，等•核因子-k B与肝纤维化中医药治疗研究进展71现代中西医结合杂志，2215628)：5184-510, 387
(收稿日期：7626-01-17)
(上接第72页7
参考文献：
[1刘文婷，姜翠雪,蔡育莹，等•慢乙肝患者HBeAv、肝功能与外周血CD/+T细胞的关系[J]1黑龙江医药科学,2218.41(3):13 [2]李卫明，王禹，刘东海，等•癫痫大鼠oiRNA14、134表达及灵芝
多糖干预711黑龙江医药科学,27183187:72
71方福德.microRNA的研究方法与应用[M]北京：中国协和出版社,2708：11
7]Sahel Samanta,Sathyamooehy,Balasubraoamaa.MicroRNA:A nee theraputic stratevy for carUiovaschlar disease[J].TrenXe Careiovasc Med,271737(3)：467
7]SWVid Wz,Szeoraj.Circalatiny oiRNAc ac nod一invasiva b i o m are-ere for nod-smalt cell luny cancer diaaxosic,progxosic and prebic-hod oO heatoenr response]J].Postepy Hiq Med Dost,277,Aug
(9):7、[6]Moth MI,D Anyeto S,Meccaeeho R.MicroRNA,cavcee and diet：
facts and new excitiny pe/pechves71Cure Mol Paroacoi:277.04
(17)：74
[7]OhuUak,Yaoamo Y,Matsuoda R.Maintaininy vood oiRNAc in the
body keep the doctoe away Pe/pechves cm the relahonsUip between food-deeved naturat p/V uc W and microRNAc in relahog h exo-sooes/extracehular vesicles71Mol Nuh Food Rec,227,78(6): 12
[8]Moszyas/aA,GebertM,Collawn JF.SNPc in MicroRNA taroet sites
and theie potentiat rote in human disease]J].Open Biot,277,47
(4)：117
7]崔世英e长嘉宁•实用oiRNA研究进展[M]北京:清华大学出版社,2713：54
(收稿日期：2022-06-7)。