神经轴突导向因子Slit2和受体Robo1、Robo4调控角膜血管新生[1]

华中科技大学
博士学位论文
神经轴突导向因子Slit2 和受体Robo1、Robo4 调控角膜血管新
生
姓名：寒溪
申请学位级别：博士
专业：眼科学
指导教师：张明昌
2010-05-22
中文摘要
背景与目的：角膜病是世界三大致盲眼病之一，中国公民因单眼和双眼角膜病致盲的盲人约四百万，占眼科致盲眼病的第2位。

新生血管是角膜病致盲的主要原因，但其机制至今尚未完全清楚，目前亦无理想治疗方法，因此探索角膜新生血管形成机制及其防治措施具有重要的理论价值和实际意义。

为了从全新的角度阐明角膜新生血管的分子机制，我们关注到与血管具有相似结构的系统——神经系统。

在生物体内，神经和血管不但距离很近，而且彼此存在很多的关联，具有解剖的相似性和功能的平行性。

鉴于神经和血管行为的相似性，两个系统可能共享相同的信号分子。

目前已证实四个神经轴突导向因子家族同时调节血管发育，即Ephrins，Semaphorins, Netrins和Slits。

我们将目标定位于神经系统中仅有单向调控作用的Slit及其受体Roundabout(Robo)家族。

本研究将探讨神经轴突导向因子Slit2和Robo受体是否参与了角膜新生血管形成。

方法：角膜囊袋法诱导大鼠角膜新生血管模型，实时荧光定量PCR测定Slit2和Robo1-4在正常角膜与新生血管角膜的差异表达，免疫组化法和原位杂交法定位。

体外培养原代的脐静脉内皮细胞，RT-PCR测定细胞Robo1-4受体的表达。

制备重组的人Slit2蛋白，测定其对血管内皮细胞迁移的影响。

结果：大鼠新生血管角膜的Slit2表达量仅为正常角膜的55 %，Robo1和Robo4受体表达量分别为正常角膜的2.7倍和1.77倍，差异呈显著性(P<0.05)。

Slit2、Robo1和Robo4受体均表达于正常角膜上皮层的全层。

随着新生血管区角膜基质中血管内皮细胞侵入的增加，上皮层表达Slit2、Robo1和Robo4减少，而基质层血管内皮细胞表达Robo1和Robo4增多。

原代的脐静脉内皮细胞仅表达Robo1和Robo4受体，且重组的人Slit2能抑制脐静脉内皮细胞的移行(P<0.05)。

结论：本研究首次探讨了神经轴突导向因子Slit2与角膜新生血管的关系。

研究发现：Slit2通过Robo1、Robo4受体介导抑制角膜病理性新生血管过程，其可能成为角膜新生血管治疗的新靶点。

关键词：新生血管，角膜；神经轴突导向因子；Slit2；Robo1；Robo4；上皮细胞；血管内皮细胞
Abstract
Background and Objective：Corneal diseases, which include infections, chemical and mechanical injuries, immunologic diseases and degenerations, are a major cause of blindness worldwide. Corneal neovascularization (NV) is involved in many corneal diseases as an imp ortant pathological process. Although a number of regulatory factors have been identified to play a role, the molecular mechanisms of corneal NV are still not fully understood and there is no ideal therapy for corneal NV currently as a result. Therefore, further investigation of pathological mechanisms that control corneal NV is needed to improve our understanding of this complex process. To elucidate the molecular mechanisms of corneal NV from a whole new angle, we focus our attention on the nervous system that possesses similar structure to the vascular system. Nerves and blood vessels are in close proximity and in connection with each other, sharing anatomical similarities and functional parallels. Given the behavioral similarities between nervous and vascular system, there may be molecular cross talk and common cues. Four families of classical neuronal guidance cues have so far been identified as regulators of vascular development: the Ephrins, Netrins, Semaphorins and Slits. We focus on the Slits family that regulates monodirectionally in nervous system. Our objective was to investigate whether neuronal guidance cue Slit2 and Roundabout (Robo) receptors are involved in corneal NV. Methods：Corneal NV model in rats was induced by implantation of agarose-coated gelfoam pellets containing basic fibroblast growth factor (bFGF) into corneal stroma. Differential expression of Slit2 and Robo1-4 between normal and neovascularized cornea was detected by real-time RT-PCR and visualized by immunohistochemistry and in situ hybridization. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were harvested and their expression of Robo1-4 was detected by RT-PCR. Recombinant human Slit2 protein was prepared and the effect of it on the migration of vascular endothelial cells was examined using cell migration assay. Results：Agarose-coated
gelfoam pellets were able to induce well-localized and reproducible corneal NV model. A significant down-regulation of Slit2 and a strong up-regulation of Robo1 and Robo4 were seen in neovascularized cornea when compared with normal cornea (P<0.05). Slit2, Robo1 and Robo4 were throughout the epithelium in normal cornea and markedly weak or absent in epithelium in neovascularized cornea, with Robo1 and Robo4 being prominent in vascular endothelial cells invading the stroma. Primary HUVECs were confirmed to express both Robo1 and Robo4 receptors and their migration was inhibited by Slit2 (P<0.05). Conclusion：This is the first study to assess the association between Slit2 and corneal NV. Our findings suggest that the interaction of Slit2 with Robo1 and Robo4 receptors plays an essential role in inhibiting pathological neovascular processes of the cornea and may represent a new therapeutic target for corneal NV.
Key words：corneal neovascularization, neuronal guidance cue, Slit2, Robo1, Robo4, epithelial cells, vascular endothelial cells
英文缩略语
缩略语
英文全称 中文全称 ARVO Association for Research in Vision and Ophthalmology
视觉和眼科研究协会
bFGF basic Fibrobast Growth Factor 碱性成纤维细胞生长
因子
BSA Bovine Serum Albumin 牛血清白蛋白 cDNA complementary Deoxyribonucleic Acid 互补脱氧核糖核酸 DAPI 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride
4',6-二脒基-2-苯基吲
哚 DEPC Dethypyrocarbonate
焦碳酸二乙酯 ECL Ecl Chemiluminescence
化学发光 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清
FITC Fluorescein Isothiocyanate 异硫氰酸荧光素
HE Hematoxylin and Eosin 苏木素-伊红
HEK293 Human Embryonic Kidney 293 cells 人胚肾293细胞
HUVEC Human Umbilical Vein Endothelial Cell 人脐静脉内皮细胞
MMPs Matrix Metalloproteinases 基质金属蛋白酶
NV Neovascularization 新生血管形成
PBS Phosphate Buffer Solution 磷酸盐缓冲液
PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应
RNA Ribonucleic Acid
核糖核酸 RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction
逆转录-聚合酶链反应
SABC Streptavidin Biotin-peroxidase Complex 链酶亲和素-生物素-
过氧化物酶复合物
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide
Gel Electrophoresis 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine N,N,N',N'-四甲基二乙
胺
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor血管内皮生长因子
独创性声明
本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。

尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。

对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。

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日期： 年 月 日
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本论文属于
不保密□。

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日期：年月日日期：年月日
前言
角膜病是世界三大致盲眼病之一，中国公民因单眼和双眼角膜病致盲的盲人约四百万，占眼科致盲眼病的第2位【1】。

新生血管是大多角膜疾病过程中的重要病理改变。

新生血管可破坏角膜免疫赦免、继发角膜水肿、混浊从而影响视力甚至致盲。

角膜移植是治疗角膜病致盲的主要方法，但血管化植床的角膜移植排斥率高达49 %【2】。

新生血管发病机制至今尚未完全清楚，目前亦无理想治疗方法，因此探索角膜新生血管形成机制及其防治措施具有重要的理论价值和实际意义。

体内的血管新生主要包括两种方式：血管生成和血管形成。

前者主要依靠内皮祖细胞或更早来源的血管母细胞聚集分化形成，是血管从无到有的过程【3】，主要见于胚胎血管系统发育过程【4】；后者指由已经存在的成熟血管内皮细胞通过局部芽生或套叠的形式生成新的毛细血管，是血管从少到多的过程【5】，主要见于胚胎后的生理性和病理性血管重构。

角膜新生血管属于后者。

新生血管要成功的建立起有功能的血管网络必须确保两个过程：第一，诱导新血管的生成；第二，导航新血管形成正确的网络。

两过程又由一系列环节组成，包括血管内皮细胞基底膜和细胞外基质的降解、内皮细胞活化、增殖、定向迁移、管腔形成、发生分枝、与其它血管吻合形成血管环等。

目前对第一过程的调控因素已较清楚，如基底膜和细胞外基质的降解与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)有关【6】，血管内皮细胞活化、增殖、迁移与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)【7】，但对第二过程的血管导航过程及调控尚未明了。

进一步的探索不仅能补充完善角膜新生血管机制而且为将来的针对性治疗提供契机。

血管分枝结构的研究令我们关注到与血管具有相似结构的系统——神经系统。

在生物体内，神经和血管不但距离很近，而且彼此存在很多的关联，具有相似的解剖结构和功能的平行性。

如血管和神经伴行着到身体的各个部位，在解剖上均具有复杂的分枝网状结构，在功能上两个系统均提供一种双向信息流(感觉和运动神经元、动脉和静脉血管流)【8】。

神经元轴突通过生长锥来感受环境中刺激。

生长锥位于轴突最顶端，含有细丝状的伪足结构，表达在伪足上的受体蛋白通过接收外界配体的刺激，向内传递信号，引导轴突的转向。

在血管发生的过程
中，毛细血管的前端有一类非常活跃的细胞，称之为“顶端细胞”【9】，顶端细胞如同生长锥，他们同样通过膜上的受体感受环境中的信号分子，通过延伸或回缩伪足调节血管的增殖速率和生长方向，引导血管分枝的形成。

轴突生长锥和内皮顶端细胞相似的行为性表明两个系统间共享相似的发育关联性，具有共同的配体/受体信号系统，其偶联引导信号探测外围环境伴随着细胞骨架的变化而变换细胞方向。

目前已证实四个神经轴突导向因子家族同时调节血管发育，即Ephrins，Semaphorins, Netrins和Slits【10】。

本课题组前期对神经轴突导向因子家族中的Netrins和Ephrins与血管新生的关系分别进行了研究。

我们发现Netrins-1对HUVEC的增殖、迁移及管腔形成具有类似神经系统中的双重作用，表现为在相对低浓度时的促进和相对高浓度时的抑制【11】。

在对兔角膜囊袋法血管新生实验中得到同样结果【12】。

本课题组也在新生血管化角膜中检测出了EphrinB2的表达【13】。

由于Netrin-1对血管形成有双向作用，而EphrinB2在炎症性血管模型中也表现出双向调节作用【14】，如将其作为治疗新生血管靶向基因具有不确定性。

于是我们将目标定位于神经系统中仅有单向调控作用的轴突导向因子Slit及其受体Roundabout(Robo)家族。

在神经系统，Slit是由胶质细胞分泌的细胞外糖蛋白【15】，通过Robo受体作为神经轴突导向和神经元迁移的调控因子。

中线衍生的Slit作为化学排斥因子阻止同侧的轴突跨越中线以及连合轴突重复跨越中线【16】。

除此之外，Slit还与一些种类的细胞的移行有关【17，18】。

在哺乳动物，Slit包括三个成员Slit1、Slit2、Slit3，其中Slit2和Slit3在神经系统外也有表达【19】。

Robo有四个亚型Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，其中Robo4仅特异性表达于血管内皮，而在其他组织不表达【20】。

Robo4受体的胞外配体是Slit2。

于是我们提出大胆的设想：Slit2/Robo是否参与了角膜新生血管形成？为了验证这一想法，本课题组进行了前期的探索性研究：采用角膜囊袋法、bFGF诱导新生血管模型，检测角膜Slit/Robo mRNA的表达，发现新生血管角膜较正常角膜的Slit2表达减低，而Robo1与Robo4表达明显增高，差别有统计学意义。

在我们前期工作取得初步结果的同时，我们惊喜的发现：2008年4月在国际权威学术期刊《Nature Medicine》上发表的关于Robo4稳定新生血管网络的文章。

该文章从不同于我们的角度研究了Robo4受体在视网膜和脉络膜血管性疾病中对血管完整性维持、渗透性改变发挥的作用【21】，更进一步支持Slit2/Robo参与新生血管形成的设想。

基于目前的研究现状，我们计划在现有研究基础上建立体内三维血管新生模型，定量分析Slit2和受体Robo在角膜组织的差异表达以及表达定位；分析Slit2对血管内皮细胞迁移、顶端细胞分枝的影响，从全新的角度全面分析角膜血管新生过程，为进一步将其作为治疗血管新生的靶向基因建立理论基础。

本研究对于了解角膜血管新生的机制，降低角膜新生血管致盲率具有重要理论价值和实际意义。

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21.Jones CA, London NR, Chen H, Park KW, Sauvaget D, Stockton RA, Wythe JD,
Suh W, Larrieu-Lahargue F, Mukouyama YS, Lindblom P, Seth P, Frias A, Nishiya N, Ginsberg MH, Gerhardt H, Zhang K, Li DY, 2008. Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability. Nat Med. 14(4), 448-453.
第一部分 Slit2、Robo1和Robo4在新生血管角膜和正常角膜的差异
表达与定位
1. 材料和方法
1.1 实验动物
健康成年Sprague-Dawley (SD) 大鼠，雌雄各半，体重200~220g，眼部经手术显微镜检查, 屈光间质透明。

由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

动物实验室温度25±2℃，湿度(65±5)%，雌雄分笼饲养，标准饲料喂养，自由饮水。

实验于适应性饲养1周后开始，符合ARVO有关用于研究目的动物的相关规定。

1.2 实验方法
1.2.1 bFGF缓释药丸的制备
(1) 主要试剂和仪器
bFGF PeproTech BSA Sigma
琼脂糖Sigma
吸收性明胶海绵金陵药业股份有限公司
高速台式离心机(TGL-16G) 上海安亭科学仪器厂
手术显微镜(OPMI VISU 200 plus) Zeiss
超净工作台(FL-CJ-1F) 上海风棱实验设备有限公司
灭菌高压锅(YX-280B) 深圳市荣华医疗器械有限公司
(2) 100 ng/µl的bFGF溶液的配制
1) 离心：在打开bFGF冻干粉管盖前，高速离心(10, 000 rpm)包装管20-30 s。

2) 溶解：加入5 mM Tris (PH 7.6)，轻摇并于冰上静置，待bFGF完全溶解，使
其浓度为1 mg/ml。

3) 分装和贮存：用含0.5 % BSA的PBS溶液进一步稀释，使其终浓度为100 ng/µl。

在冰上分装溶液并冻存于-20℃。

(3) 缓释药丸的制备
改良文献【1】报道的方法，制备缓释药丸。

在手术显微镜下将无菌的吸收性明胶海绵剪成1 mm×1 mm×0.1 mm的规则大小，浸入4℃的PBS缓冲液过夜后，无菌滤纸吸干水分。

滴加1 μl (100ng/µl) bFGF溶液于明胶海绵小片上，室温下置于超净工作台内干燥48h。

将药丸浸入2 %琼脂糖溶液包裹后再置于超净工作台内干燥48h备用。

以上全部过程严格遵守无菌操作。

1.2.2 角膜囊袋法诱导大鼠角膜新生血管模型
(1) 主要药品和器械
10 %水合氯醛华中科技大学同济医学院附属协和医院倍诺喜滴眼液日本参天制药株式会社
裂隙穿刺刀(3.0 mm) Alcon
月型刀(2.3 mm) Alcon
手术显微镜(OPMI VISU 200 plus) Zeiss
(2) 动物模型的制备
改良文献【2】报道的方法，向大鼠角膜微囊袋内植入bFGF缓释药丸，诱导局部角膜新生血管形成。

1) 57只SD大鼠，右眼为缓释药丸植入眼，左眼为非手术对照眼。

全部手术均由同一人操作。

2) 手术器械的消毒：全部非一次性手术器械事先高压蒸汽灭菌半小时。

3) 麻醉(全麻+局麻)
a 全麻：10 %水合氯醛(350mg/kg)腹腔内注射麻醉。

b 局麻：眼局部滴用倍诺喜(0.4 %盐酸奥布卡因)滴眼液2次。

4) 体位：大鼠侧卧于木板上。

5) 手术：手术在手术显微镜下进行，严格遵守无菌操作。

a 消毒：0.5 %活力碘消毒右眼及其周围的毛发。

b 显微镊固定大鼠眼球。

c 用裂隙穿刺刀，在距角巩膜缘约2.5 mm处的角膜上作长约2 mm、1/2角膜厚的线性切口。

d 月型刀从线性切口深入，平行于角膜平面在角膜基质内作潜行隧道，形成一大小约2 mm×1.5 mm的囊袋，囊袋底端距角巩膜缘1 mm。

e 显微镊夹取bFGF缓释药丸送至囊袋内。

f 氯霉素眼膏涂眼。

待麻醉苏醒后送回笼中。

6) 术后处理：每天涂氯霉素眼膏2次。

1.2.3 角膜新生血管的观察、测定
(1) 大体观察
1) 全麻：10 %水合氯醛(350mg/kg)腹腔内注射麻醉。

2) 手术显微镜下观察
角膜水肿、新生血管生长情况以及有无并发症。

后者包括感染、前房出血、虹膜前粘连和晶状体混浊等。

对出现手术并发症的大鼠排除于实验之外，并及时补充相应数量。

(2) 定量测定
1) 最大新生血管长度：以连续且弯曲度小、并与角膜缘切线垂直的新生血管长度为准，取最大血管长度。

2) 新生血管钟点数：新生血管网的跨圆周钟点数。

1.2.4 角膜组织的收集
(1) 手术后第8天收集大鼠的角膜组织。

(2) 处死：腹腔内注射过量的10 %水合氯醛并颈椎脱臼。

(3) 在手术显微镜下，用显微剪小心剪下药丸植入眼中新生血管区域的角膜，命名为“新生血管角膜”。

于非手术对照眼的同一部位小心剪下同等大小的角膜，命名为“正常对照角膜”。

(4) 收集的角膜组织用生理盐水冲洗以去除血液等杂质，并立即用于后续实验。

1.2.5 角膜组织的病理学检测
(1) 主要试剂和仪器
多聚赖氨酸Sigma
电热恒温干燥箱(DHG-9040AS) 宁波东南仪器有限公司
石蜡包埋机(BMJ-III) 常州中威电子仪器厂
石蜡切片机(RM 2235) Leica
病理组织漂烘仪(PHY-III) 常州中威电子仪器厂
生物显微镜(DM4000B) Leica
数字彩色图象照相机(DFC300FX) Leica
(2) 石蜡切片的制作
1) 固定：将角膜置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h。

2) 脱水和透明：
3) 浸蜡：65 ℃60 %乙醇20 min 70 %乙醇20 min 80 %乙醇30 min 90 %乙醇30 min 95 %乙醇Ⅰ30 min 95 %乙醇Ⅱ20 min 无水乙醇Ⅰ30 min 无水乙醇Ⅱ30 min 二甲苯Ⅰ15 min 二甲苯Ⅱ15 min
石蜡Ⅰ 15 min 石蜡Ⅱ 25 min 石蜡Ⅲ
30 min
4) 包埋
5) 切片：以4或6 μm 厚度连续切片，置于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。

6) 烤片：60℃烤片1小时，存放于干燥处备用。

(3) HE 染色
1) 石蜡切片脱蜡至水：
2) 苏木素染色5 min ，自来水冲洗。

3) 1 %盐酸乙醇分化30 s(提插数下)，流水冲洗至显微镜下见细胞核呈蓝色即可，清水中放置5min 。

4) 伊红复染2 min 。

5) 脱水和透明：
二甲苯Ⅰ 10 min 二甲苯Ⅱ 10 min 无水乙醇Ⅰ 10 min 无水乙醇Ⅱ 10 min 95 %乙醇 10 min 90 %乙醇 10 min 80 %乙醇 10 min 70 %乙醇 10 min 蒸馏水
2 min
95 %乙醇Ⅰ 1 min 95 %乙醇Ⅱ 1 min 无水乙醇Ⅰ 1 min 无水乙醇Ⅱ 1 min 二甲苯石碳酸(3：1) 1 min 二甲苯Ⅰ 1 min 二甲苯Ⅱ
1 min
5) 脱水和透明：
6) 中性树脂封片，生物显微镜下观察、摄影。

1.2.6 实时荧光定量PCR测定Slit2和Robo1-4在角膜组织的表达
(1) 主要试剂和仪器
DEPC Sigma Trizol Invitrogen 琼脂糖Sigma
RevertAid TM逆转录试剂盒Fermentas
SYBR Green Realtime PCR试剂盒Toyobo
台式高速冷冻离心机(5417 R) Eppendorf
分光光度计(LibraS21) Biochrom
电泳仪(DY-501B) 上海琪特分析仪器有限公司
凝胶成像分析系统(GIS-2020D) Scientz
超低温冰箱(MDF U32V) Sanyo
PCR仪(T3000) Biometra
Bio-Rad
荧光定量PCR仪
(DNA Engine Opticon 2)
(2) 引物设计
根据GenBank公布的大鼠Slit2、Robo1、Robo2、Robo3和Robo4基因的cDNA 序列(GenBank登录号依次为：AF141386、NM_022188、XM_213677、NM_001108135和NM_181375)以及管家基因β-actin的cDNA序列(GenBank 登录号：NM_031144.2)，利用Primer 5.0软件设计特异性的PCR引物。

引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

具体如下表1。

表1 大鼠Slit2、Robo1-4和β-actin基因引物序列
基因名称引物序列(5’-3’) 退火温度(℃) 产物大小(bp)
59 210
GTGCGTCTGGTGTGAATGAG
Slit2 F:
R: ATGCTCCTGGTGCAACTGTG
GAAGCATCAGCCACTTTGACAG
58 337 Robo1 F:
R: GGTCCGCAATCACATCAGTAAC
ACCCCCAGTTCCACCATTAGG
60 204 Robo2 F:
R: GCAGAGCCCCATCCATTTACC
63 172
GGGGGTGATCGCAACAGCAGTAT
Robo3 F:
R: GTAGCAGTCCCCGGAACATCACAG
65 329 Robo4 F:
GGCCCCACCTCCTGCTGAAAAC
R: GGACGGCACCACTGGCAATGACT
58-65 317 AGGCTGTGTTGTCCCTGTAT
β-actin F:
R: CAGCTCATAGCTCTTCTCCA
(3) 实验器具的处理与准备
1) 塑料制品(吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于37 ℃1 ‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水) 2 h，灭菌水淋洗数次，100 ℃干烤15 min，高压蒸汽灭菌15 min，后
在80 ℃烤箱中烘干，实验前将枪头放入吸头台。

2) 玻璃制品(主要是玻璃研磨器)
将玻璃制品泡酸过夜，自来水冲洗干净，在1 ‰DEPC水中浸泡8 h，37 ℃
烘干，锡纸包裹180 ℃干烤3 h以上。

3) 金属制品(镊子、剪刀等)
洗净后180 ℃干烤6h。

(4) 角膜组织总RNA的提取
1) 匀浆化作用
取新鲜分离的新生血管角膜和对应的正常对照角膜各5个，分别放入2个玻璃研磨器内。

加入1 ml Trizol后充分研磨角膜组织，室温下静置10 min。

将Trizol 裂解液移至预先做好标记的1.5 ml EP管中，4 ℃离心12, 000 rpm×5 min，小心吸取上清至新的EP管。

2) 分离阶段
加入200 μ1氯仿，盖严EP管盖，剧烈振荡15 s，溶液呈乳白色液体状。

室温放置2-3 min后， 4 ℃离心12, 000 rpm×15 min。

溶液分成三层：无色的上层、白色的中间层以及红色的下层，小心吸取上层溶液至新的EP管(切忌吸入中间层)。

3) RNA的沉淀
加入500 μ1异丙醇，轻轻颠倒EP管混匀，室温放置l0 min，4 ℃离心12, 000 rpm×10 min，EP管底的小块白色沉淀即为总RNA。

4) RNA的洗脱
小心弃去上清，留取沉淀。

加入l ml现配的75 %乙醇(DEPC水配制，预冷)，震荡洗涤，悬浮沉淀，4 ℃离心7, 500 rpm×5 min。

5) RNA的再溶解
小心弃去上清，置沉淀于空气中干燥5-10 min，视沉淀量加入适量的DEPC 水溶解RNA。

6) RNA的保存
提取的RNA保存于-70 ℃超低温冰箱或立即用于cDNA的合成。

(5) 总RNA纯度和完整性的检测
1) 总RNA纯度的测定
取 2 μ1总RNA作适当稀释，分光光度计测OD260/OD280的比值。

取OD260/OD280比值在1.8-2.0的总RNA进行实验。

总RNA浓度(μg/ml)= OD260×40×稀释倍数。

2) 总RNA完整性的检测
取5 μ1总RNA进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统分析。

取28s rRNA 亮度约为18s rRNA 2倍的总RNA 进行实验。

(6) cDNA 的合成
1) 根据RevertAid TM 逆转录试剂盒的操作指南进行cDNA 的合成。

2) 在100 μl EP 管中加入下列反应物(冰上操作)：
3) Tip 头吹打混匀，短暂离心，70 ℃孵育5 min 后，立刻冰上孵育5 min 。

4) 在上述EP 管中继续加入反应物(冰上操作)：
5) Tip 头吹打混匀，短暂离心，37 ℃孵育5 min 。

6) 最后加入1 μl M-MuLV 逆转录酶至总体积20 μl ，Tip 头吹打混匀，短暂离心，42 ℃孵育60 min 进行逆转录。

7) 70 ℃孵育10 min 灭活逆转录酶。

8) 合成的cDNA 保存于-20 ℃冰箱或立即进行实时荧光定量PCR 。

(7) 实时荧光定量PCR
1) 根据SYBR Green Realtime PCR 试剂盒的操作指南进行荧光定量PCR 。

2) 反应体系：
SYBR Green Realtime PCR Master Mix
10 μl 10 μM 上游引物
0.8 μl 10 μM 下游引物
0.8 μl DNA 模板
1 μl DEPC 水
加至总体积20 μl
3) 反应条件：
总RNA 2 μg
Oligo(dT)18 1
μl DEPC 水 加至总体积12 μl
5×反应缓冲液
4 μl RNA 酶抑制剂
1 μl dNTP 混合物
2 μl
a 预变性
95 ℃ 3 min b 变性
95 ℃ 15 s c 退火
具体温度见表1 30 s d 延伸
72 ℃ 45 s
e 读板检测荧光强度
f 重复b-e 40个循环
g 60-95 ℃做溶解曲线，每0.5 ℃读板一次，时间为1秒
4) 每个标本做2个复孔，3组不同标本重复3次。

5) 2-△△Ct 法计算靶基因的相对表达量：
arg arg 0()()T et Actin TimeX T et Actin Time Ct Ct Ct Ct Ct ΔΔ=−−−【3】
6) 扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 免疫组化法定位Slit2和Robo1在角膜组织的表达
(1) 主要试剂和仪器
羊抗Slit2多克隆抗体(sc-26599)
SantaCruz 兔抗Robo1多克隆抗体(sc-25672) SantaCruz
SABC(山羊IgG)-POD 试剂盒 武汉博士德公司
SABC(兔IgG)-POD 试剂盒 武汉博士德公司
DAB 显色试剂盒
武汉博士德公司 生物显微镜(DM4000B)
Leica 数字彩色图象照相机(DFC300FX) Leica
(2) 免疫组化SABC 法
1) 石蜡切片脱蜡至水
取4 μm 厚的角膜石蜡切片，脱蜡方法同HE 染色。

PBS 洗5 min ×3次。

2) 阻断、灭活内源性过氧化物
新鲜配制的3 %过氧化氢室温孵育15 min ，PBS 洗5 min ×3次。

3) 抗原热修复
将切片浸入0.01 M柠檬酸缓冲液，微波炉加热至沸腾后断电，冷却至室温，重复2次。

自然冷却后PBS洗5 min×3次。

4) 封闭
吸水纸擦干组织周围的PBS，血清室温封闭15 min，甩去多余血清。

5) 一抗孵育
擦干组织周围的封闭血清，稀释的一抗(1:100)4 ℃孵育过夜，PBS洗5 min ×3次。

6) 二抗孵育
擦干组织周围的PBS，生物素化二抗室温孵育20 min，PBS洗5 min×3次。

7) SABC孵育
擦干组织周围的PBS，SABC室温孵育20 min，PBS洗5 min×4次。

8) DAB显色
取l ml蒸馏水，加DAB显色试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后滴加至切片。

室温显色，显微镜下掌握染色程度。

自来水冲洗5 min中止反应。

9) 复染
苏木素复染3-5 min，自来水冲洗返蓝。

10) 脱水、透明和封片
方法同HE染色。

以未添加一抗的稀释液孵育的切片作为空白对照。

镜下观察，以细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为染色阳性的判断标准。

1.2.8 原位杂交法定位Robo4在角膜组织的表达
(1) 主要试剂和仪器
武汉博士德公司
敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ
(过氧化物酶)
DAB显色试剂盒武汉博士德公司
生物显微镜(DM4000B) Leica
数字彩色图象照相机(DFC300FX) Leica。