呋喃唑酮快速检测试剂盒说明书

-01版呋喃唑酮代谢物（AOZ）快速检测试剂盒说明书
一、原理
本试剂盒采取间接竞争ELISA方法检测水产和鸡肉等组织样本中AOZ, 在微孔条上预包被上偶联抗原, 利用抗原与抗体特异性免疫化学反应原理来进行, 样本中AOZ和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗呋喃唑酮代谢物衍生物抗体, 加入酶标识物后, 用TMB底物显色, 样品中AOZ含量与样品吸光度值呈反比, 与标准曲线比较即可得出呋喃唑酮代谢物含量。

二、试剂盒技术指标:
试剂盒灵敏度: 0.05ppb
样本检测下限:
组织（鸡/鸭/猪/牛/羊/鱼/虾肉）—---——0.1ppb
肝脏（鸡/鸭/猪/牛/羊肝脏）--------———0.1ppb
蜂蜜、牛奶、肠衣--------------------------—0.1ppb 鱼/虾等水产品组织因存在一定干扰,
检测下限为0.2ppb
交叉反应率: 呋喃唑酮代谢物————————————100%呋喃它酮代谢物———————————﹤0.1% 呋喃妥因代谢物———————————﹤0.1% 呋喃西林代谢物———————————﹤0.1% 回收率:
组织、肝脏……………………………90%±10% 蜂蜜、牛奶、肠衣……………………75%±15%
三、试剂盒组成
1、微量测试孔: 每条8孔, 一板12条
2、标准液X6瓶: （1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、
0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
3、酶标识物12m l………………………红色帽
4、抗体工作液7m l………………………蓝色帽
5、底物A液7 m l………………………白色帽
6、底物B液7 m l………………………黑色帽
7、终止液7 m l………………………黄色帽
8、20X浓缩洗涤液40 m l…………………白色帽
9、2X浓缩复溶液50 m l…………………透明帽
10、衍生化试剂10m l…………………白色帽
四、所用仪器、试剂
含有仪器: 微孔酶标仪、打印机、均质器、氮
气吹干装置、振荡器、离心机、
刻度移液管、天平（感量0.01g）微量移液器: 单道20µl-200µl, 100µl-1000µl、多
道250µl
试剂:
氢氧化钠、乙酸乙酯、正己烷、浓HCl、磷酸氢二钾（全部样本使用）
亚硝基铁氰化钾（K2Fe（CN）5·NO·3H2O）、ZnSO4·7H2O（奶样专用）
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时, 都必需注意:
（a）本试剂盒所检测组织样本包含: 动物组织、禽类和水产组织。

eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、
虾等。

（b）试验中必需使用一次性吸头, 在吸收不一样试剂时要更换吸头。

（c）试验之前须检验多种试验器具是否洁净, 必需时可对试验器具进行清洁, 以避免污染干扰
试验结果。

样本前处理需配制:
配液1:用去离子水将2×浓缩复溶液按1: 1 稀释, 用于提取后样本复溶
配液2: C液: （供奶样用）称12.5g亚硝基铁氰化钾用去离子水定溶至100ml。

D液: （供奶样用）称29.8g 硫酸锌用去
离子水溶解定溶至100ml。

配液3: 0.1MK2HPO4 称22.8g K2HPO4·3H2O
加去离子水溶解定溶至1L
配液4: 1M HCl取8.6ml浓HCl加水定溶至100ml。

配液5: 1M NaOH称取4g NaOH加水定溶至100ml。

样本处理方法:
(a) 奶样
1、取出5ml奶样本到玻璃离心管中,分别加入C
液和D液各250µl。

2、用振荡器充足混合样本,用恒温离心机
4000r/min以上离心10min(4-12℃).若没有恒
温离心机,则先将样本降温至大约8℃,然后离
心。

3、接(b)描述方法
(b)组织、蜂蜜、肠衣、肝脏
1、取1±0.05g均质样本(组织、蜂蜜、肠衣、
肝脏), 牛奶离心上清液1.1ml（相当1ml
奶样）, 分别加入4ml去离子水, 0.5ml1M
HCl和100µl衍生化试剂, 充足振荡。

2、置于37℃过夜孵育（大约16h）或56℃水浴中
孵育(2h);
3、分别加入5ml 0.1M K2HPO4, 0.4 ml 1M
NaOH和5ml乙酸乙酯, 充足振荡5min;
4、在室温下（20-25℃）4000r/min以上离心
10min。

5、取出2.5ml乙酸乙酯到另一洁净容器中
于50℃氮气/空气吹干。

6、用1ml正己烷溶解干燥物, 用1ml已稀释
好复溶液充足混合30s; 在室温下（20-25℃）
4000r/min以上离心10min。

7、取50µl下层相用于分析。

样本稀释倍数: 2
六、酶标免疫分析程序
1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂, 置室温
（20-25℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量微孔及框架, 将不用微孔放入自
封袋, 保留于2-8℃。

3、配液: 将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去
离子水根据1: 19稀释（1份浓缩洗涤液+19份
去离子水）, 或按所需用量配制洗涤液。

4、编号: 将样本和标准品对应微孔按序编号, 每
个样本和标准品做2孔平行, 并统计标准孔和
样本孔所在位置。

5、加标准品/样本50µl/孔到各自微孔中, 然后加
抗体50µl/孔, 用盖板膜封板, 轻轻震荡混匀。

25℃环境中反应1h。

6、取出将孔内液体甩干, 用洗液250µl/孔洗板4-5
次, 每次间隔15-30秒, 用吸水纸拍干（拍干后
未被清除气泡可用洁净枪头刺破）。

7、每孔加入酶标识物100µl, 盖板膜盖板后置
25℃环境中反应30min。

将孔内液体甩干, 用
洗涤液充足洗, 4-5遍（同上）, 用吸水纸拍干
（拍干后未被清除气泡可用洁净枪头刺破）。

8、显色: 每孔加入底物A液50µl, 再加底物B液
50µl, 轻轻振荡混匀, 25℃环境中避光显色
30min。

9、测定: 每孔加入终止液50µl, 轻轻振荡混匀,
设定酶标仪于450nm处（提议用双波长
450/630nm检测, 在5min内读完数据）, 测定
每孔OD值。

七、结果判定
结果判定有两种方法, 粗略判定可用第1种方法, 定量判定用第2种方法。

注意样本吸光值与AOZ 含量成负相关。

1、粗略判定:
用样品平均吸光度值与标准值比较即可得出
样本所含AOZ浓度范围（ng/ml）。

假设样品1吸光度值为0.268, 样品2吸光度值为1.230, 标准液吸光度值分别是: 0ppb为1.671; 0.05ppb为1.425; 0.15ppb为1.103; 0.45ppb为0.567;
1.35ppb为0.205; 4.05ppb为0.104。

则样品1
浓度范围是0.45ppb-1.35ppb; 样品2浓度范围是0.05ppb-0.15ppb。

乘以其对应稀释倍数即为样本中AOZ实际浓度。

2、定量判定:
所取得每个浓度标准溶液和样本吸光度值平
均值（B）除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）再乘以100%, 即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝ B ×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标, 以AOZ标准品浓度（ng/ml）半对数为横坐标, 绘制标准曲线图。

将样本百分吸光率代入标准曲线中, 从标准曲线
上读出样本所对应浓度, 乘以其对应稀释倍数即
为样本中AOZ实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算, 更便
于大量样品正确、快速分析。

八、注意事项
1、用前将全部试剂温度回升至室温20-25℃。

2、用以后立刻将全部试剂放回2-8℃冰箱。

3、在ELISA分析中再现性, 很大程度上取决于洗
板一致性, 仔细根据推荐洗板次序操作是
ELISA测定程序中关键点。

4、全部恒温孵育过程中, 避免光线照射, 用盖
板膜封住微孔板。

5、室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温
（20-25℃）会造成全部标准OD值偏低。

6、在洗板过程中假如出现板孔干燥情况, 则会
伴伴随出现标准曲线不成线性, 反复性不好
现象。

所以洗板拍干后应立刻进行下一步操
作。

7、混合要均匀, 不然会出现反复性不好现象。

8、反应终止液为2M硫酸, 避免接触皮肤。

9、不要使用过了有效日期试剂盒, 稀释或搀杂
使用会引发灵敏度、 OD值改变。

不要交换使
用不一样批号盒中试剂。

10、不用微孔板放进自封袋密封; 标准物质和无
色发色剂对光敏感, 所以要避免直接暴露在
光线下。

11、显色液若有任何颜色表明变质, 应该弃之。

0
标准吸光度值小于0.5时, 表示试剂可能变
质。

12、该试剂盒最好反应温度为25℃, 温度过高或
过低将造成检测吸光度值和灵敏度发生改变。

九、储藏条件和保质期
储藏条件: 试剂盒于2-8℃保留, 不要冷冻。

保质期: 该产品使用期为1年, 生产日期见
包装盒。

提醒: 酶标板真空包装袋若有漏气, 酶标板仍然正常有效, 不影响试验结果, 请放心使用。