异硫氰酸苄酯通过激活p53和AMPK-FOXO1a信号通路诱导宫颈癌细胞周期阻滞和凋亡

网络出版时间：２０２４－０１－１０１０：５７：４９　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２４０１０８．１８３１．０４０
异硫氰酸苄酯通过激活ｐ５３和ＡＭＰＫ ＦＯＸＯ１ａ信号通路
诱导宫颈癌细胞周期阻滞和凋亡
塔玛莎·库尔曼江，王小静，李欣奕，王昊，解国轩，陈云杰，温婷，程夕露，努尔阿米乃·麦麦提，李金玉
（新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆特殊环境物种多样性应用与调控重点实验室，
新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐　８３００５４）
收稿日期：２０２３－０８－１９，修回日期：２０２３－１１－２０
基金项目：新疆维吾尔自治区重点研发计划项目子课题资助项目
（Ｎｏ２０２２Ｂ０３０１８ ５）；新疆特殊环境物种多样性应用与调
控重点实验室资助项目（ＸＪＴＳＷＺ ２０２１ ０２）；新疆师范大
学博士启动基金资助项目（Ｎｏ３０１００１０２６７）。

作者简介：塔玛莎·库尔曼江（１９９９－），女，硕士生，研究方向：药理
学，Ｅ ｍａｉｌ：１３２６４３１１１５＠ｑｑ．ｃｏｍ；
王小静（１９７２－），女，博士，硕士生导师，研究方向：药理
学，共同第一作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｗｘｊｄｙ＠１６３．ｃｏｍ；
李金玉（１９７８－），女，博士，副教授，硕士生导师，研究方
向：药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｌｉｊｉｎｙｕ２３４＠１６３．ｃｏｍ；
努尔阿米乃·麦麦提（１９９０－），女，博士，讲师，研究方
向：药理学，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：Ｍｙｎｕｒａ＠１２６．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０７０６７
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２４）０１－０１１４－１２
中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２９ ２５；Ｒ３２９ ２８；Ｒ３９４ ２；
Ｒ７３７ ３３；Ｒ９７９ １
摘要：目的　研究异硫氰酸苄酯（ｂｅｎｚｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＢＩＴＣ）
对小鼠Ｕ１４宫颈癌细胞增殖的影响，基于转录组数据分析
探讨细胞毒性机制。

方法　ＭＴＴ法检测ＢＩＴＣ对Ｕ１４细胞
活性的影响，Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８和荧光倒置显微镜检测细胞核
形态变化，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ
Ｎｏｖａｓｅｑ６０００测序平台建立ＢＩＴＣ（２０μｍｏｌ·Ｌ－１）给药前后
Ｕ１４细胞转录组数据库，使用生物信息学分析手段对差异基
因功能和信号通路进行富集分析。

ｑＲＴ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ
验证信号通路关键分子表达变化。

结果　ＢＩＴＣ呈时间和浓
度依赖性抑制Ｕ１４细胞的活性，阻滞细胞在Ｇ０／Ｇ１期，诱导
了细胞凋亡，上调了Ｂａｘ、ＣｙｔＣ、ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ９／３、下调了
Ｂｃｌ ２、ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ７的表达量；通过转录组分析，差异基
因主要富集在细胞周期、ＦＯＸＯ、ｐ５３、细胞凋亡等信号通路，
ｑＲＴ ＰＣＲ或Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证ｐ５３、ｐ２１、Ｉｒｅ１ａ、Ａｔｆ４、ＣＨＯＰ、
ＡＭＰＫ、ＦＯＸＯ１ａ等分子表达上调，ＣｙｃｌｉｎＤ３，ＣｙｃｌｉｎＥ，Ｃｄｋ２
分子表达下调。

结论　ＢＩＴＣ阻滞Ｕ１４细胞周期、通过
ｃａｓｐａｓｅ ３线粒体依赖途径和内质网应激途径诱导细胞凋亡，
其机制与ｐ５３和ＡＭＰＫ ＦＯＸＯ１ａ信号通路有密切关系。

关键词：异硫氰酸苄酯；宫颈癌；转录组；ｐ５３；ＦＯＸＯ；细胞周
期；细胞凋亡
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）： 宫颈癌是全球女性癌症相关发病率和死亡率的主要原因之一。

２０２０年全球宫颈癌新发病例６０ ４万，发病率１５ ６／１０００００；死亡病例３４ ２万，死亡率８ ８／１０００００［１］。

尽管通过人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）疫苗接种和筛查可高度预防宫颈癌。

对已经感染ＨＰＶ的中晚期宫颈癌患者，仍迫切需要寻找新的高效、低毒抗宫颈癌药物。

通过饮食蔬菜和水果是有效预防癌症的手段。

异硫氰酸酯（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ，ＩＴＣｓ）是广泛存在拟南芥、油菜、旱金莲、水芹、卷心菜、甘蓝、萝卜等十字花科蔬菜中的一种天然抗癌活性分子，是由前体硫苷在体内黑芥子酶作用下水解而来［２］。

到目前为止，已经报道了几十种天然的或半合成的异硫氰酸盐，以莱菔硫烷（ｓｕｌｆｏｒａｐｈａｎｅ，ＳＦＮ）、苯乙基异硫氰酸酯（ｐｈｅｎｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＰＥＩＴＣ）和异硫氰酸苄酯（ｂｅｎｚｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＢＩＴＣ）报道较多。

ＢＩＴＣ在结构上带有一个芳香环侧链和一个高度亲电的碳原子中心，水解时会产生活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ），因此造成脱氧核糖核酸氧化损伤［３］。

研究证实，ＢＩＴＣ是一种有效的化学保护剂，它可以防止啮齿类动物的化学致癌作用，同时也具有抗癌作用。

在不同的体内外实验中发现，ＢＩＴＣ能够诱导多种肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞、抑制细胞迁移和侵袭、抑制血管生成和诱导细胞自噬。

其中，乳腺癌、胰腺癌、肺癌是报道较多的肿瘤［４－５］。

此外，研究证明，ＢＩＴＣ对正常组织无毒性，是一种安全的有潜力的抗癌活性物质［６］。

然而，ＢＩＴＣ对宫颈癌的作用及其机制未有详尽报道。

本研究初步评估了ＢＩＴＣ对小鼠宫颈癌细胞Ｕ１４的细胞毒性，通过ＲＮＡ ｓｅｑ分析、ｑＲＴ ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法探讨了ＢＩＴＣ抑制Ｕ１４细胞增殖的作用机制，为开发和利用ＢＩＴＣ用于宫颈癌治疗提供理论依据。

·４１１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）：１１４～２５
１　材料与方法
１．１　实验药物　ＢＩＴＣ（９８％，Ｃ７Ｈ２Ｆ３ＮＳ）购于上海源叶公司，使用前溶于ＤＭＳＯ中，配置成２００ｍｍｏｌ·Ｌ－１的母液，过滤除菌后，４℃冰箱储存，使用时用ＤＭＥＭ培养液对其进行稀释。

１．２　细胞培养　将Ｕ１４细胞（新疆医科大学生物实验室）接种在含ＤＭＥＭ培养皿（含１０％ＦＢＳ和１％双抗）中，３７℃、５％ＣＯ
２
培养箱中培养。

１．３　试剂　ＭＴＴ（３（ ４，５ 二甲基噻唑 ２） ２，５ 二苯基四氮唑溴盐）、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司；顺铂（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）购自上海源叶生物有限公司；ＤＭＥＭ培养基、胰蛋白酶、双抗（青霉素１０ｋＵ·ｍＬ－１和链霉素１０ｇ·Ｌ－１混合液），胎牛血清（ＦＢＳ）购自ＢＩ公司；ＢＣＡ蛋白定量试剂盒，ＥＣＬ显色剂，β ａｃｔｉｎ、Ｂｃｌ ２、ＣｙｔＣ、Ｂａｘ、ｐ２１、ＭＤＭ２、ＣｙｃｌｉｎＤ３、ＣＤＫ２、ＣｙｃｌｉｎＥ、ＡＭＰＫ、Ｆｏｘｏ１α二抗山羊抗兔ＩｇＧ购自上海碧云天生物技术有限公司；ｃａｓｐａｓｅ３／７／９、ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ３／７／９购自ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ公司。

１．４　仪器　ＤＹＣＺ ２４ＤＮ型电泳槽（北京六一），ＤＹＣＺ ４０Ｄ型转膜槽（北京六一），ＤＹＹ １０Ｃ型电泳仪（北京六一），Ｉｌｌｕｍｉｎａ测序平台（上海美吉生物公司），Ｃｙｔｏｆｌｅｘ流式细胞仪（美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司）１．５　方法　
１．５．１　ＭＴＴ法检测Ｕ１４细胞增殖活性　将对数生长期的细胞按照２×１０３／孔接种于９６孔板中培养，每孔１００μＬ，３７℃过夜培养２４ｈ后，弃上清，用ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）和０ １％ＤＭＳＯ（相当于６０μｍｏｌ·Ｌ－１ＢＩＴＣ工作液中ＤＭＳＯ的浓度）分别处理Ｕ１４细胞２４、４８、７２ｈ，以不加配合物为空白对照，Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ为阳性对照。

每个组别设置６个平行孔。

将上清吸出，在避光的环境下，每孔内添加无血清培养基配置的ＭＴＴ１００μＬ，细胞培养４ｈ后，吸出上清，再加入２００μＬＤＭＳＯ，振荡孵育１０ｍｉｎ，使其充分溶解结晶紫。

酶标仪４９０ｎｍ处读取每孔吸光度值，按照如下公式计算细胞的相对活性： 细胞的相对活性＝实验组平均Ａ值／对照组平均Ａ值×１００％
１．５．２　Ｈｏｅｃｈｓｔｓｔａｉｎｉｎｇ３３２５８染色法检测细胞核形变化　将对数生长期的Ｕ１４细胞按照１×１０５／孔接种于２４孔板中于３７℃细胞培养箱中培养过夜，加入不同终浓度的ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）处理细胞２４ｈ后，每孔添加预冷的４％多聚甲醛５００μＬ，４℃冰箱固定１０ｍｉｎ，固定后，每组细胞用ＰＢＳ洗涤，滴加用ＰＢＳ溶液稀释的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色溶液以１∶１００，孵育５ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗涤３次（５ｍｉｎ／次），然后直接使用荧光显微镜观察染色。

１．５．３　流式细胞术检测细胞凋亡和周期　对数生长期的Ｕ１４细胞按照８×１０５／皿接种到６０ｍｍ的细胞培养皿中，用不同终浓度的ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）处理１２ｈ后，１２００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ收集细胞，收集的细胞沉淀用３０μＬＰＢＳ重悬后，每个样品分别加入膜联蛋白Ｖ ＦＩＴＣ染液５μＬ和ＰＩ染液５μＬ，冰上避光孵育３０ｍｉｎ；对于细胞周期，细胞沉淀先用７０％乙醇固定过夜，去除乙醇后，用３０μＬＰＢＳ重悬细胞，然后每个样品加入ＰＩ染液５μＬ冰上避光染色３０ｍｉｎ，充分混匀后上流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期分布。

１．５．４　转录组样品和数据处理　将对数生长期的细胞按照５×１０６／皿接种于１００ｍｍ细胞培养皿中培养２４ｈ后，用不同终浓度的ＢＩＴＣ（０、２０μｍｏｌ·Ｌ－１）分别处理Ｕ１４细胞６ｈ和１８ｈ后取样。

每个处理做３个生物学平行组。

以不加ＢＩＴＣ作为空白对照，培养６ｈ的３个空白对照组分别标记为Ｋ６ １、Ｋ６ ２、Ｋ６ ３。

ＢＩＴＣ处理６ｈ的３个实验组分别标记为Ｂ６ １、Ｂ６ ２、Ｂ６ ３，培养１８ｈ的空白对照组分别标记为Ｋ１８ １、Ｋ１８ ２、Ｋ１８ ３。

ＢＩＴＣ处理１８ｈ的实验组分别标记为Ｂ１８ １、Ｂ１８ ２、Ｂ１８ ３。

共计１２个样品用锡箔纸包裹后立即置于液氮中速冻。

采用ＴＲＩｚｏｌ试剂盒提取样品ＲＮＡ，利用琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测ＲＮＡ的浓度和纯度，质量合格后，进一步富集纯化ｍＲＮＡ，片段化逆转录得到双链ｃＤＮＡ。

然后依次末端修复，拼接，ＰＣＲ扩增构建ｃＤＮＡ文库。

使用ＩｌｌｕｍｉｎａＮｏ ｖａｓｅｑ６０００进行转录组测序得原始数据（ｒａｗｄａｔａ），采用Ｆａｓｔｐ分析软件对ｒａｗｄａｔａ进行过滤，去除接头和低质量的ｒｅａｄｓ后得到Ｃｌｅａｎｄａｔａ。

使用Ｈｉｓａｔ软件，将Ｃｌｅａｎｄａｔａ和参考基因组进行比对，获得后续分析的有效数据（ｍａｐｐｅｄｒｅａｄｓ）。

１．５．５　表达量分析及差异基因筛选　利用ＲＳＥＭ软件对基因的表达水平进行定量分析，使用转录组条目（ＴＰＭ）为表达量指标，进行样本间基因差异的表达分析。

使用ＤＥＳｅｑ２软件并以Ｐ＜０ ０５、ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ（ＦＣ）≥２和ＦＣ≤０ ５为筛选条件获得比较组间差异表达基因（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓ，ＤＥＧｓ）。

１．５．６　ＧＯ功能和ＫＥＧＧ富集分析　利用Ｂｌａｓｔ２ＧＯ软件将ＤＥＧｓ在ＧＯ（ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ）数据库进行比对获得ＧＯ功能注释，利用Ｇｏａｔｏｏｌｓ软件对ＤＥＧｓ进行ＧＯ富集分析；将ＤＥＧｓ在ＫＥＧＧ
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中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
（ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ）数据库进行比对获得ＫＥＧＧ通路注释信息。

采用Ｆｉｓｈｅｒ精确检验，以Ｐ＜０ ０５时表示ＧＯ功能和ＫＥＧＧ通路出现了显著富集。

１．５．７　实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ ＰＣＲ）分析　ＢＩＴＣ（０、２０μｍｏｌ·Ｌ－１处理细胞６ｈ后采用ＴＲＩｚｏｌ试剂盒提取样品总ＲＮＡ，利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５ ０设计ｑＲＴ ＰＣＲ引物（Ｔａｂ１），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

按ＳｕｐｅｒＲｅａｌ荧光定量预混试剂盒说明书，以β ａｃｔｉｎ为内参基因，采用相对比较２－ΔΔＣｔ法对部分差异基因的表达水平进行定量检测，应用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９软件作图分析。

Ｔａｂ１　Ｉｒｅ１ａ，Ａｆｔ４，β ａｃｔｉｎａｎｄｏｔｈｅｒｇｅｎｅｐｒｉｍｅｒｓｄｅｓｉｇｎ
ＮａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′ ３′）
Ｉｒｅ１ａＦ：ＴＡＡＧＧＡＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＴＡＣＡＣ
Ｒ：ＡＡＴＴＣＡＣＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＧ
Ａｆｔ４Ｆ：ＡＡＧＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＡＣ
Ｒ：ＡＡＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣ
ＣＨＯＰＦ：ＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡ
Ｒ：ＴＴＧＧＧＴＣＴＡＡＴＣＴＴＧＧＴＧＴＧ
ＣｙｃｌｉｎＤ３Ｆ：ＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＧＧ
Ｒ：ＡＣＣＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡ
ＣｙｃｌｉｎＥＦ：ＴＴＡＴＣＡＧＴＧＧＴＧＣＧＡＣＡＴＡＧ
Ｒ：ＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧ
Ｃｄｋ２Ｆ：ＴＣＴＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＡＣ
Ｒ：ＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡ
Ｐ２１Ｆ：ＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＴＧ
Ｒ：ＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＧＴＧＣ
ＭＤＭ２Ｆ：ＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＡ
Ｒ：ＣＣＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＧＡＧ
β ａｃｔｉｎＦ：ＡＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡ
Ｒ：ＡＴＧＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＴＡ
１．５．８　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测凋亡相关蛋白表达　将对数生长期的细胞按照５×１０６／皿接种于１００ｍｍ细胞培养皿中，于３７℃细胞培养箱中培养２４ｈ后，加入不同浓度的ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）处理１２ｈ，离心收集细胞，加入ＲＩＰＡ裂解液冰上裂解２０ｍｉｎ，离心保留上清，使用ＢＣＡ法对细胞上清中的总蛋白含量进行定量。

总蛋白采用１２％ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分离后，转至硝酸纤维素（ＰＶＤＦ）膜。

使用５％脱脂奶粉于室温封闭２ｈ后，ＴＢＳＴ洗涤３次，１５ｍｉｎ／次，加入一抗（β ａｃｔｉｎ、Ｂｃｌ ２、Ｂａｘ、ＣｙｔＣ、ｃａｓｐａｓｅ ３／７／９、ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ３／７／９）３７℃孵育２ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３次，然后加入二抗（ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ）３７℃孵育１ｈ，ＴＢＳＴ洗涤３次，按１∶１比例加入发光Ａ液和Ｂ液，暗室显色，用凝胶成像仪观察显影蛋白条带。

１．５．９　统计学分析　所有数据用Ｇｒａｐｈｐａｄｐｒｉｓｍ９
软件进行统计分析，数据均显示为ｍｅａｎ±ＳＤ，ｎ＝３。

采用单因素方差分析。

与Ｃｏｎｔｒｏｌ相比，Ｐ＜０ ０５具有差异显著性。

２　结果
２．１　ＢＩＴＣ对Ｕ１４细胞活力的影响　用不同浓度的ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）处理细胞２４、４８、７２ｈ后，ＢＩＴＣ显著抑制了Ｕ１４细胞的增殖作用（Ｐ＜０ ００１）（Ｆｉｇ１Ａ），７２ｈ的抑制率分别为６２ ６３％、９２ ５６％、９５ ４２％（Ｆｉｇ１Ｂ），３个时间段的ＩＣ５０值分别是２２ ５４μｍｏｌ·Ｌ－１、１５ ３９μｍｏｌ·Ｌ－１、１２ ４３μｍｏｌ·Ｌ－１。

与Ｃｏｎｔｒｏｌ组相比，随着ＢＩＴＣ处理浓度的增加，细胞形态逐渐变圆，贴壁能力减弱，细胞数量显著下降（Ｆｉｇ１Ｃ）。

２．２　ＢＩＴＣ诱导了Ｕ１４细胞核ＤＮＡ凝聚　不同浓度的ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）作用ＨｅＬａ细胞２４ｈ后，采用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色，倒置荧光显微镜观察，如Ｆｉｇ２所示，Ｃｏｎｔｒｏｌ组可见细胞形态完整，细胞染色均匀，但ＢＩＴＣ组染色质浓缩，蓝白荧光强，且随着浓度增加，细胞荧光比例增加，核碎片现象加重，表明ＢＩＴＣ作用于细胞ＤＮＡ，可能诱导Ｕ１４细胞凋亡。

２．３　ＢＩＴＣ诱导Ｕ１４细胞阻滞　如Ｆｉｇ３所示，ＢＩＴＣ处理Ｕ１４细胞１２ｈ后，显著增加了Ｇ
０
／Ｇ
１
期细胞比例（Ｐ＜０ ０５），降低了Ｓ期细胞分布（Ｐ＜
０ ０１）。

同时，也观察到Ｇ
２
／Ｍ期细胞随着浓度增加先上升后降低。

揭示ＢＩＴＣ主要诱导细胞周期阻滞
在Ｇ
０
／Ｇ
１
期。

２．４　ＢＩＴＣ诱导Ｕ１４细胞凋亡　诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的手段之一。

细胞凋亡途径主要有外源性死亡受体途径、内源性内质网途径、内源性线粒体途径［７］。

为了进一步确认ＢＩＴＣ是否诱导了Ｕ１４细胞凋亡，不同浓度的ＢＩＴＣ（０、２０、４０、６０μｍｏｌ·Ｌ－１）作用Ｕ１４细胞１２ｈ后，通过ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＰＩ双染，流式细胞仪检测分析显示，与Ｃｏｎｔｒｏｌ相比，随着ＢＩＴＣ浓度的增加，ＢＩＴＣ剂量依赖性地诱导了细胞凋亡（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１），细胞凋亡率从最初的７ ８１％上升到８６ ４％（Ｆｉｇ４Ａ）。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ进一步分析显示（Ｆｉｇ４Ｂ），与Ｃｏｎｔｒｏｌ相比，促凋亡蛋白Ｂａｘ、ＣｙｔＣ、ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ３／９表达显著增加（Ｐ＜０ ０５和Ｐ＜０ ０１），抑制凋亡蛋白Ｂｃｌ ２、ｃａｓｐａｓｅ ３／７／９、ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ７蛋白表达显著下降（Ｐ＜０ ０１）。

这些结果表明，ＢＩＴＣ可通过线粒体途径诱导Ｕ１４细胞凋亡。

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·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
Ｆｉｇ４　ＥｆｆｅｃｔｏｆＢＩＴＣｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＵ１４ｃｅｌｌｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
ＴｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＵ１４ｃｅｌｌｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ａ：Ｔｈｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｄｏｔｐｌｏｔｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗｅｒｅｓｈｏｗｅｄｉｎｔｈｅｕｐｐｅｒｐａｎｅａｎｄｔｈｅｓｕｍｍａｒｙｄａｔａｏｆｃｅｌｌａｐｏｔｏｓｉｓｒａｔｅｗｅｒｅｃｏｕｎｔｅｄｉｎｔｈｅｌｏｗｅｒｐａｎｅ；Ｂ：ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．１：Ｂａｘ；２：Ｂｃｌ ２；３：ｃａｓｐａｓｅ３；４：ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ３；５：ｃａｓｐａｓｅ７；６：ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ７；７：ｃａｓｐａｓｅ９；８：ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ９；９：ＣｙｔＣ；１０：β ａｃｔｉｎ． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
２．５　差异基因筛选　采用ＲＳＥＭ软件和ＤＥＳｅｑ２
软件进行差异筛选分析，如图Ｆｉｇ５所示，经ＢＩＴＣ６
ｈ处理后，以空白组作为对照，在ＢＩＴＣ处理组细胞
中共获得２４４７个ＤＥＧｓ，其中下调基因１３０８个，上
调基因１１３９个。

经ＢＩＴＣ１８ｈ处理后，共获得
１８２４个ＤＥＧｓ，其中下调ＤＥＧｓ有８８３个，上调ＤＥＧｓ
有９４１个。

由于ＢＩＴＣ作用６ｈ的差异基因较多，以
下通路富集分析主要呈现６ｈ转录组数据。

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·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
Ｆｉｇ５　ＮｕｍｂｅｒｏｆＤＥＧｓｉｎＵ１４ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＢＩＴＣｆｏｒ６
ｈｏｒ１８ｈｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌ
２．６　ＧＯ功能注释和分类分析　对ＤＥＧｓ进行功
能分类，主要包括三个类别：生物过程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｐｒｏｃｅｓｓ，ＢＰ）、细胞组分（ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ＣＣ）和
分子功能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＭＦ）。

经ＢＩＴＣ处理
Ｕ１４细胞６ｈ后，统计富集ＤＥＧｓ数量排名前２０的
功能分类（Ｆｉｇ６）。

ＤＥＧｓ富集于ＢＰ的主要有：细胞
进程（ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓ）（１４７５个基因）、生物调节
（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（１２５３个基因）；富集于ＣＣ的
有：细胞成分（ｃｅｌｌｐａｒｔ）（１７６６个基因），细胞器（ｏｒ
ｇａｎｅｌｌｅ）（１２３３个基因），细胞器成分（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ
ｐａｒｔ）（１０２７个基因）；富集于ＭＦ的主要有：结合
（ｂｉｎｄｉｎｇ）（１５６９个基因）。

Ｆｉｇ６　ＴＯＰ２０ＧＯｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｎｏｔａｔｉｏｎａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓｏｆＤＥＧｓｉｎＵ１４ｃｅｌｌｓｂｅｔｗｅｅｎＢＩＴＣａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ
２．７　ＫＥＧＧ通路富集分析　对ＤＥＧｓ进行ＫＥＧＧ
通路富集统计，柱状图（Ｆｉｇ７）展现前２０个显著的
富集途径。

如Ｆｉｇ７显示，ＢＩＴＣ作用Ｕ１４６ｈ后，
ＤＥＧｓ主要富集在细胞周期（Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ）、ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ
ｉｎｃａｎｃｅｒ、ＦＯＸＯ信号通路、Ｆａｎｃｏｎｉａｎｅｍｉａｐａｔｌｒａｖａｙ
信号通路、ＭＡＰＫ信号通路、ｐ５３信号通路和细胞凋
亡等途径（Ｐ＜０ ０５）。

Ｆｉｇ７　ＴＯＰ２０ＫＥＧＧｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆＤＥＧｓｉｎＵ１４ｃｅｌｌｓｂｅｔｗｅｅｎＢＩＴＣａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ２．８　细胞通路分析及验证　２．８．１　ＢＩＴＣ通过ｐ５３信号通路诱导Ｕ１４细胞周期阻滞　ｐ５３参与各种生物反应的激活，主要包括调控细胞周期停滞、ＤＮＡ修复和细胞凋亡。

ＫＥＧＧｐａｔｈｗａｙ分析表明，在ＢＩＴＣ处理Ｕ１４６ｈ后，参与ｐ５３信号通路的差异基因有１８个（Ｆｉｇ８），其中有９个基因表达上调，如鼠双微体（ｍｕｒｉｎｅｄｏｕｂｌｅｍｉｎｕｔｅ２，Ｍｄｍ２）基因，细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子１Ａ（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１Ａ，Ｐ２１）基因；下调基因９个，如细胞周期基因ＣｙｃｌｉｎＤ３、ＣｙｃｌｉｎＥ，细胞周期蛋白依赖性激酶２基因（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ２，ＣＤＫ２）。

根据流式细胞周期与转录组数据分析结果，为了验证ＢＩＴＣ是否通过调控ｐ５３细胞通路将Ｕ１４细胞阻滞在Ｇ０／Ｇ１期，我们采用ｑＲＴ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证上述基因及相关蛋白，如Ｆｉｇ９Ａ、９Ｂ所示，Ｐ２１基因，ＭＤＭ２基因及蛋白均表达上调，Ｇ０／Ｇ１期相关调控基因ＣｙｃｌｉｎＤ３基因，ＣｙｃｌｉｎＥ基因，Ｃｄｋ２基因及蛋白均下调。

ｐ５３基因虽在转录水平无明显变化（与转录组数据一致），但在蛋白水平显著上升，这可能与转录后调控有关。

综上所述，ＢＩＴＣ可通过调控ｐ５３信号通路将细胞阻滞在Ｇ０／Ｇ１期。

２．８．２　ＢＩＴＣ也可通过内源性凋亡途径诱导Ｕ１４细胞凋亡　对ＢＩＴＣ作用Ｕ１４细胞６ｈ富集在细胞凋亡途径中的ＤＥＧｓ分析发现（Ｆｉｇ１０），尽管没有看到ｃａｓｐａｓｅ的变化，但下游信号的切割作用底物，如促进细胞皱缩和膜泡发生的Ａｃｔｉｎ基因表达上调，而
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９１１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
Ｆｉｇ８　ｐ５３ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｄｉａｇｒａｍｏｆＢＩＴＣｏｎＵ１４ｃｅｌｌ
ｓ
Ｆｉｇ９　ＥｆｆｅｃｔｏｆＢＩＴＣｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ５３ａｎｄｃｅｌｌｃｙｃｌｅｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓ
Ａ：ｑＲＴ ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓＢ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ
与有丝分裂相关的微管蛋白α ｔｕｂｕｌｉｎ以及与ＤＮＡ
周期，复制，分化，凋亡相关的核纤层蛋白Ｌａｍｉｎ基
因下调，表明ＢＩＴＣ引发了凋亡。

此外，转录组数据
分析发现内质网应激凋亡途径中内质网应激激活肌
醇酶１ａ（ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｋｉｎａｓｅ／ｅｎ
ｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １，Ｉｒｅ１ａ）基因，转录激活因子４（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ４，Ａｔｆ４）基因，Ｃ／ＥＢＰ转录因子
（Ｃ／ＥＢＰｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＨＯＰ）基因表达上调。

我们又进一步通过ｑＲＴ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证了
ＢＩＴＣ是否通过另一内源性途径诱导细胞凋亡。

如
Ｆｉｇ１１所示，内质网应激Ｉｒｅ１ａ基因、Ａｔｆ４基因、ＣＨＯＰ基因及蛋白表达均显著升高（Ｐ＜０ ０５），表明ＢＩＴＣ也可通过内源性内质网应激途径（ｅｎｄｏ ｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓ，ＥＲＳ）诱导Ｕ１４细胞凋亡。

２．８．３　腺苷酸活化蛋白激酶（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５′ ｍｏｎｏ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＭＰ） ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ） 叉头转录因子Ｏ亚家族Ｓ（ｆｏｒｋｈｅａｄｂｏｘＯ，ＦＯＸＯ）通路在ＢＩＴＣ诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡中发挥重要作用　ＡＭＰＫ是细胞发育重要的调控因子。

ＦＯＸＯ作为ＡＭＰＫ调控的下游转录因子，通过调控靶基因参与细胞死亡、存活以及多种信号转导途径，这些途径对细胞增殖、凋亡、周期阻滞、分化等功能
·０２１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
至关重要［８］。

ＫＥＧＧｐａｔｈｗａｙ分析表明，在ＢＩＴＣ处理６ｈ后，Ｕ１４细胞参与ＦＯＸＯ通路的差异基因有３１个（Ｆｉｇ１２），其中有２０个基因表达上调，如ＡＭＰＫ基因，生长阻滞与ＤＮＡ损伤基因（ｇｒｏｗｔｈａｒ ｒｅｓｔａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｉｂｌｅａｌｐｈａ，Ｇａａｄｄ４５ａ），生长阻滞和ＤＮＡ损伤诱导蛋白４５ｇ（ｇｒｏｗｔｈａｒｒｅｓｔａｎｄＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ４５ｇ，Ｇａｄｄ４５ｇ）基因。

１１个基因表达下调，如细胞信号转导分子Ｓｍａｄ３、ｐ３８，细胞周期蛋白Ｂ（ＣｙｃｌｉｎＢ）基因、细胞周期蛋白依赖性激酶２（ｃｙｃｌｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ２，ＣＤＫ２）基因。

我们进一步通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测了ＦＯＸＯ通路相关基因的表达，发现ＡＭＰＫ，ＦＯＸＯ１ａ蛋白表达上调（Ｆｉｇ１３），推测ＡＭＰＫ ＦＯＸＯ通路可能参与ＢＩＴＣ诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡。

３　讨论
ＩＴＣｓ是十字花科主要的次生代谢产物，定位于细胞质中，是由前体硫苷在体内黑芥子酶作用下水解而来，在植物受损时释放，可阻止多环芳香烃、
偶
Ｆｉｇ１０　ＡｐｏｐｔｏｓｉｓｐａｔｈｗａｙｏｆＵ１４ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＢＩＴ
Ｃ
Ｆｉｇ１１　ＥｆｆｅｃｔｏｆＢＩＴＣｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｓｔｒｅｓｓｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌｅｓ
Ａ：ｑＲＴ ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓＢ：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ． Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓＣｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
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１
２
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中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
Ｆｉｇ１２　ＦＯＸＯ１ａｐａｔｈｗａｙｏｆＢＩＴＣｏｎＵ１４ｃｅｌｌｓ
成凋亡小体。

Ｈｏｃｈｅｓｔ３３２５８染色结果表明，ＢＩＴＣ可诱导Ｕ１４细胞核ＤＮＡ凝聚，与ＢＩＴＣ对卵巢癌ＯＶＣＡＲ ３细胞相同的是［１６］，它们都能观察到细胞核可见的颗粒状荧光，初步推测其为凋亡小体。

进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡率，分析发现ＢＩＴＣ剂量依赖性地增加了细胞凋亡率，表明ＢＩＴＣ诱导了细胞凋亡。

这与转录组ＫＥＧＧ分析的结果相一致。

外源性死亡受体途径和内源性途径（包含线粒体途径和内质网途径）是细胞发生凋亡的主要途径，这两条途径汇聚最终激活下游凋亡蛋白酶ｃａｓｐａｓｅ从而引发凋亡。

线粒体途径主要受控于Ｂｃｌ ２家族蛋白，通过促凋亡蛋白（Ｂａｘ、Ｂａｋ等）和抗凋亡蛋白（Ｂｃｌ ２、Ｂｃｌ ＸＬ等）的相互作用，从而对线粒体膜的通透性产生影响，继而触发凋亡释放因子的释放，由此激活上游凋亡起始子ｃａｓｐａｓｅ ９，造成下游效应分子ｃａｓｐａｓｅ ３、７被激活，通过切割相应的底物（ｌａｍｉｎ、ａｃｔｉｎ、α ｔｕｂｌｉｎ、ＰＡＲＰ等），最后引发细胞凋亡［１７］。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果分析发现，ＢＩＴＣ使促凋亡蛋白Ｂａｘ上调，而下调了抗凋亡蛋白Ｂｃｌ ２表达的水平，引起了线粒体促凋亡信号ＣｙｔＣ的释放，将ｃａｓｐａｓｅ ９激活之后，继而激活了下游效应分子ｃａｓｐａｓｅ ３。

研究发现ｃａｓｐａｓｅ ３和 ７在细胞凋亡中具有重叠但不同的作用，二者具有细胞类型和刺激依赖性［１５］。

本研究中，ＢＩＴＣ没有激活ｃａｓｐａｓｅ ７，表明ｃａｓｐａｓｅ ３是ＢＩＴＣ主要的线粒体凋亡依赖途径。

这一研究结果与另一异硫氰酸酯ＳＦＮ在抗宫颈癌的作用机制类似［１８］。

此外，本研究中未检测到经典凋亡通路下游切割底物ｃｌｅａｖｅ ＰＡＲＰ的表达，这可能与转录后翻译、调控有关。

细胞在应对内质网错误折叠蛋白和钙离子平衡紊乱时，会通过Ｉｒｅ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６通路启动另一内源性凋亡途径［１９］。

许多中草药及其有效成分通过ＥＲＳ通路发挥抗宫颈癌作用［２０－２２］。

本研究中，对细胞凋亡通路富集的ＤＥＧｓ分析发现：内质网应激途径Ｉｒｅ１α、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ基因表达升高。

进一步通过ｑＲＴ ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证这些分子的表达，与预期结果相一致，提示ＥＲＳ在ＢＩＴＣ诱导的宫颈癌细胞凋亡中扮演者重要的角色。

有趣的是ＳＦＮ预处理经Ｈ２Ｏ２诱导的软骨细胞，下调了ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、Ｂａｘ和ｃａｐａｓｅ ３、Ｂｃｌ ２水平，减少了ＥＲＳ依赖性细胞凋亡［２３］。

ＢＩＴＣ是否也在非癌细胞具有相同的保护作用，值得进一步研究。

ＡＭＰＫ是细胞全身能量稳态的中枢能量传感器和调节器［２４］，一旦激活，ＡＭＰＫ可以促进分解代谢产生ＡＴＰ，从而帮助细胞逃避死亡并导致耐药性和转移。

然而，ＡＭＰＫ也与ｐ５３和ＬＫＢ１等肿瘤抑制基因呈正相关［２５］，最新的研究证明ＡＭＰＫ的药理激活能够抑制各种癌细胞生长［２６－２７］，但ＡＭＰＫ在癌症中的双重作用机制仍未阐明。

ＦＯＸＯ１蛋白家族是一大类转录因子，参与或协同其他转录因子对靶基因进行转录调控，在哺乳动物中主要有四个亚型，其中ＦＯＸＯ１ａ转录因子被认为是一种肿瘤抑制因子，在抑制癌细胞增殖和诱导细胞凋亡方面发挥作用［２８］。

有研究表明，二甲双胍通过激活ＡＭＰＫ ＦＯＸＯ１ａ信号通路抑制雌激素依赖性的子宫内膜癌细胞生长［２９］。

用ＡＩＣＡＲ（５ 氨基咪唑 ４ 甲酰胺１ β Ｄ 呋喃核糖苷）和氨甲蝶呤联合处理乳腺癌ＭＣＦ ７细胞，发现二者通过激活ＡＭＰＫ和ＦＯＸＯ１ａ而阻滞ＭＣＦ ７细胞周期并逆转其Ｗａｒｂｕｒｇ代谢［３０］。

本研究中，ＫＥＧＧ分析发现ＦＯＸＯ１ａ通路是ＤＥＧｓ主要富集的通路，进一步通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测到ＡＭＰＫ及ＦＯＸＯ１ａ蛋白表达显著增高，表明ＢＩＴＣ可能通过调控ＡＭＰＫ ＦＯＸＯ１ａ通路来诱导细胞凋亡或阻滞细胞周期，下一步尚需通过细胞模型和动物模型实验验证。

综上，体外和转录组数据分析表明，ＢＩＴＣ诱导了Ｕ１４细胞周期阻滞，通过线粒体途径和内质网途径诱导细胞凋亡，这与ｐ５３信号通路、ＡＭＰＫ ＦＯＸＯ１ａ通路密切相关。

这些研究为ＢＩＴＣ预防或治疗宫颈癌提供了新的靶点。

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３２１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
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ｓｔｒｅｓｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆＰＩ３Ｋ／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ，２０２１，２０（２１）：２２２１－３２．
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１７．
［３０］ＦｏｄｏｒＴ，ＳｚáｎｔóＭ，Ａｂｄｕｌ ｒａｈｍａｎＯ，ｅｔａｌ．ＣｏｍｂｉｎｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＭＣＦ ７ｃｅｌｌｓｗｉｔｈＡＩＣＡＲａｎｄｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ，ａｒｒｅｓｔｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｓＷａｒｂｕｒｇｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｈｒｏｕｇｈＡＭＰ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉ ｎａｓｅ（ＡＭＰＫ）ａｎｄＦＯＸＯ１［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１６，１１（２）：ｅ０１５０２３２．
Ｂｅｎｚｙｌｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｉｎｄｕｃｅｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅａｒｒｅｓｔａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｔｈｒｏｕｇｈａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐ５３ａｎｄＡＭＰＫ ＦＯＸＯ１ａｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓＫＵＲＭＡＮＪＩＡＮＧＴａｍａｓｈａ，ＷＡＮＧＸｉａｏ ｊｉｎｇ，ＬＩＸｉｎ ｙｉ，ＷＡＮＧＨａｏ，ＸＩＥＧｕｏ ｘｕａｎ，
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·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）
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网络出版时间：２０２４－０１－１０１１：０１：２７　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２４０１０８．１８３１．０３４
◇抗炎免疫药理学◇
雷公藤多苷纳米粒的制备及其对关节炎大鼠的治疗作用
王志荣，李　?，张振强，闫　敏，武香香，曾华辉
（河南中医药大学中医药科学院，河南郑州　４５００４６）
ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０３０３７
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２４）０１－０１２５－０８中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４ １；Ｒ３６４ ５；Ｒ５９３ ２２；Ｒ９４４ ９摘要：目的　制备雷公藤多苷纳米粒，探究其对胶原诱导型（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＣＩＡ）关节炎大鼠的治疗作用。

方法　运用薄膜分散法制备雷公藤多苷纳米粒，对其进行质量评估。

构建ＣＩＡ模型，进行药物干预，称量大鼠体质量、测定足趾肿胀度和关节炎指数；观察大鼠脏器、膝、踝关节滑膜的病理改变；检测大鼠血清中肝肾功能水平和炎症因子表达。

结果　制备的雷公藤多苷纳米粒在电镜下呈圆粒状且分布均匀，性质稳定。

相较于模型组，给药组大鼠左右足趾肿胀度均明显下降（Ｐ＜０ ０１），关节炎指数明显降低（Ｐ＜０ ０１）。

其中ＴＧ ＮＰｓ组的疗效优于ＴＧ组。

与正常组相比，大鼠心脏、脾、肾、睾丸指数均明显降低（Ｐ＜０ ０５，Ｐ＜０ ０１）。

ＴＧ ＮＰｓ组膝踝关节软骨病理损伤明显减轻，凋亡的滑膜细胞增加；与模型组相比，ＴＧ ＮＰｓ组大鼠血清中的ＡＬＴ、ＢＵＮ、ＣＲＥ水平均明显降低（Ｐ＜０ ０５），ＩＬ １β、ＴＮＦ α和Ｉ
Ｌ ６含量下降收稿日期：２０２３－０８－０５，修回日期：２０２３－１２－２３
基金项目：河南省科技研发计划联合基金（优势学科培育类）－培育
项目（Ｎｏ２２２３０１４２００６０）；河南省自然基金面上项目（Ｎｏ２２２３００４２０４８２）；河南省优秀青年基金资助项目（Ｎｏ２１２３００４１００５７）
作者简介：王志荣（１９９７－），女，硕士生，研究方向：中药药理，Ｅ
ｍａｉｌ：８８４７７５６８５＠ｑｑ．ｃｏｍ；
曾华辉（１９７６－），男，博士，硕士生导师，研究方向：雷公藤药理、毒理，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｈｈｚｅｎｇ＠ｈａｃｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ
明显（Ｐ＜０ ０５）。

结论　ＴＧ ＮＰｓ通过诱导滑膜细胞凋亡和降低炎性细胞因子的表达对ＣＩＡ有较好的治疗作用，通过静脉注射血液循环，可实现药物的缓、控释，避免口服药物造成的首过效应，减轻脏器的毒性，为治疗类风湿关节炎的新型纳米制剂的开发提供了实验依据。

关键词：雷公藤多苷；纳米粒；新型给药系统；类风湿关节炎；ＣＩＡ模型；炎症因子；毒性
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）是一种自身免疫性疾病，以持续的炎症和关节损伤为特
征［
１］。

主要的病理变化是滑膜细胞的增生和骨的破坏；对软骨、骨和其他邻近组织的损害往往是不可
逆的，并且在疾病的后期阶段会造成残疾［
２］。

引起ＲＡ的原因很复杂，包括遗传因素、吸烟、微生物感
染、激素、寒冷刺激和饮食等［
３］。

炎性细胞因子在ＲＡ的免疫病理中起着重要作用，如白细胞介素６（ＩＬ ６）、白细胞介素１β（ＩＬ １β）和肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ α）等水平升高，可诱导炎症细胞浸润和滑膜细胞增生。

目前没有药物可完全治愈ＲＡ，临床上常用的药物有非甾体类抗炎药（ＮＳＡＩＤｓ）和糖皮质·
５２１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２４Ｊａｎ；４０（１）：１２５～３２。