贝母素甲逆转细菌多重耐药性(MAR)的临床与实验研究

２０００年中国博士后学术大会论文集
贝母素甲逆转细菌多重耐药性（ＭＡＲ）的临床与实验研究
摘要关键词
李仝胡凯文孙颖立李英林
（北京中医药大学第一临床医学院，１００７００】
为探讨浙贝母对ＭＡＲ作用及机理，我们采用试管二倍稀释法研究了贝母素甲盐（ＦＭＨｃ！）、利血平（对照组）对三株细菌（敏感、耐药菌）的增敏越转作用；采用流武细胞仪分析药物浓度。

、结果证实：浙贝母具有逆转ＭＡＰ作用，抑制耐药茵细胞摸上的主动外排是其作用机制之一。

通过比较治疗组在综合疗效、止咳化痰、控制肺部哮呜音、清除致病菌及免疫调节作用方面明显优于对照组。

说明浙贝母在逆转ＭＡＰ方面具有较好的应用前秉，极有可能从中开发出高效、低毒的新一代耐药逆转剂。

多重对药细菌浙贝母贝母素甲实验研究临床研究
细菌多重耐药问题日趋严重，虽有多种复合抗生素应用于ｆＩ缶床，丝毫没有阻止细菌耐药的进程。

异搏定、环胞菌素Ａ（ＣｓＡ）、利血平是公认的在体外具有明显逆转ＭＡＰ作用的细菌耐药逆转剂，因其毒副作用大，无法广泛应用。

我们选用利血平作为阳性对照，研究了ＰＭ．Ｈｄ对细菌耐药性的影响。

结果证实：浙贝母具有细菌耐药逆转剂特性，中药中存在细菌耐药逆转剂是勿庸质疑，从中有可能开发出高效、低毒的细菌耐药逆转剂。

ｌ实验研究
１．１材料和方法
（１）菌株、药物与试剂：敏感菌共３株（即金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌各１株）、贝母素甲（ＰＭ）、环丙沙星注射液、刺血平注射液、柔红霉素（ＤＮＲ）、盐酸、氢氧化钠、营养肉汤、营养琼脂、氰氯苯腙（ｃｏｏｐ）。

（２）主要设备：超净工作台、培养箱、高速离心机、显微镜、高压消毒锅、流式细胞仪。

（３）体外药敏试验：①测定药物的抑菌作用。

使用试管二倍稀释法，分别测定环丙沙星、ＰＭ．Ｈｃｌ、利血平对三株细菌（敏感菌、耐药茵）的最小抑菌浓度（Ｍ１Ｃ）。

②联合药敏试验。

比较Ｈ｛．Ｈｃｌ＋环丙沙星与利血平＋环丙沙星对三种细菌的耐药逆转作用。

（４）细菌内药的浓度测定：利用柔红霉素（ＤＮＲ）自身发荧光的特点，采用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）分析增敏／逆转剂对耐药菌内ＤＮＲ蓄积水平的影响。

医药学与生物学分册
１．２结果
（１）药物对敏感菌的体外抑菌作用：①环丙沙星对敏感菌ＭＩＣ测定：环丙沙星（起始浓度２／ｔｇ／ｒｎｔ）对三种敏感菌ＭＩＣ值十分接近，波动在０．０５２０８±０．０１８０４ｔｚｇ／ｍｌ。

②ＰＨ．Ｈｃｌ及利血平对敏感菌体外抑菌试验。

Ｐｈ．Ｈｃｌ（起始浓度５ｍｇ／ｍ１）、利血平（起始浓度ｌｍｇ／ｍ１）体外抑菌试验结果表明，Ｐｈ．Ｈｄ、利血平原液浓度对三株敏感菌均无抑菌作用。

（２）药物对耐药菌的体外抑菌作用：①环丙沙星对耐药菌ＭＩＣ值测定。

环丙沙星（起始浓度２０ｔ－ｇ／ｍ１）对耐药菌ＭＩＣ值约为敏感菌ＭＩＣ值的１００倍，为４．１６７±１．４４３ｖｔｇ／“。

②ＰＨ．Ｈｃｌ、利血平对耐药菌体外抑菌试验。

ＰＨ．ＨｃＩ（起始浓度５ｍｇ／ｍ１）、利血平（起始浓度ｌｍｇ／ｍ１）体外抑菌试验结果表明，ＰＨ．Ｈｅｌ、利血平原液浓度对三株耐药菌均无抑制作用
（３）细菌对环丙沙星耐药倍数测定结果：金葡球菌耐药８０倍，大肠杆菌１１５倍，绿脓杆菌６４倍。

三株敏感菌经环丙沙星诱导后，其耐药倍数不同，大肠杆菌耐药倍数最高，绿脓杆菌最低。

（４）联合药敏试验：联合药敏试验中，环丙沙星均使用小于相应耐药菌ＭＩＣ浓度，且ＰＨ．Ｈｃｌ与利血平浓度保持相同，以便于比较。

①能量抑制剂ＣＣＣＰ对耐药菌ＭＩＣ的影响。

使用能量抑制剂氰氯苯腙（ＣＣＣＰ１０ｕｇ／ｍ１）处理后，三株耐药菌对环丙沙星高度敏感，环丙沙星对耐药菌的ＭＩＣ相当于敏感菌ＭＩＣ值。

说明主动外排是三种细菌的主要耐药机制。

②增敏剂对耐药菌增敏作用比较。

当两种增敏剂浓度相同时，其增敏指数不同，利血平的增敏指数强于ＰＨ．Ｈｃｌ５～１０倍；随着增敏剂浓度增加，浓度与其增敏指数之间有剂量依赖关系。

但到一定浓度时，再加大增敏剂浓度，其增敏指数不再相应加大；而且，部分抑菌浓度（ＦＩＣ）均小于０．５，表明两种增敏剂与环丙沙基均有协同作用。

（５）贝母素甲对耐药菌内柔红霉素蓄积水平的影响。

利用柔红霉素自身发荧光的特点，采用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）检测贝母素甲对耐药菌内柔红霉素浓度的变化，以反映贝母素甲对耐药细菌内抗菌药物蓄积水平的影响。

结果表明：甲素可增加耐药菌内柔红霉紊蓄积水平。

２临床研究
２．１病例来源
均为１９９８年２月～１９９９年１月北京中医药大学东直门医院血液科及呼吸科住院病人。

２．２病例选择
血液病患者病情较重，为便于临床观察，我们选择慢性支气管炎病人作用观察对象。

诊断标准、症状、体征分度、疗效判断标准均参照卫生部制定颁布的（中药新药临床研究指导原则》（１９９５）中有关内容。

２．３研究方法
（１）治疗分组：本组病例共６０例，随机分为治疗组３０例，对照组３０例；
（２）给药方法：治疗组：环丙沙星２００ｍｇ，静脉滴注，每日２次；浙贝母散剂１５９，每日２
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次，温开水调服。

对照组：环丙沙星２００ｍｇ，脉滴注，每日２次。

（３）疗程：两周为一个疗程。

（４）观察内容：一般性ｌ盎床资料分析、主要症状与体征变化、肺部Ｘ线变化、实验室指标、外周血白细胞计数，血浆ＩｇＡ、ｌｇＭ、ＩｇＧ、巴、ｃ４。

（５）细菌学检查：采用ＮＣＣＬＳ标准，用纸片法测定其抑菌直径。

（６）安全性指标观测：观察治疗前后患者尿、便常规、肝肾功能、心电图以及胃肠道反应。

２．４结果
（１）一般临床资料分析：经统计学处理，两组在性别、年龄、病程、病情、发病诱因、平均体温、检出细菌敏感性（均指对环丙沙星敏感、耐药）上无显著性差异，Ｐ＞０．０５，具有可比性。

（２）临床疗效分析：治疗组在综合疗效、咳嗽、咯痰、退热、肺部哮鸣音改善、外周血白细胞变化、免疫球蛋白、补体变化、细菌学疗效方面明显优于对照组，Ｐ＜００１，有极显著性差异。

’
（３）浙贝母散剂用量：从小剂量开始用起，浙贝母散剂１５９，每日２次，治疗组３０例病人均未出现不良反应，安全性指标检查未见明显异常。

３讨论
（１）浙贝母与细菌耐药逆转剂。

浙贝母为常用的清热化痰中药，味苦，性寒，归肺、心经，具有清热化痰、解毒教结作用。

贝母素甲为浙贝母中含量较多、隶属于异甾类生物碱中的瑟文类生物碱。

研究结果表明：浙贝母的主要成分贝母素甲、贝母索乙的盐酸盐均具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用，可以提高耐药肿瘤细胞内化疗药物的蓄积水平；其作用主要为抑制耐药肿瘤细胞膜上的ＰｇＰ蛋自的过度表达，从而提高了耐药细胞对化疗药物的敏感性。

本研究证实：贝母素甲通过抑制耐药菌主动外排泵、增加耐药菌内抗生素的蓄积水平，从而发挥逆转细菌耐药作用，增敏倍数为４～１５倍。

这不仅为防治细菌耐药展示了一个新的研究方向，也有可能从与其结构相似的其他瑟文类生物碱中开发出更多的新一类逆转剂。

浙贝母具有较强的止咳化痰及缓解平滑肌痉挛的作用，与文献报道一致。

从其退热时间、降低外周血白细胞、调节免疫机制及细菌学疗效方面分析，浙贝母的主要有效成分在体外并无直接抑杀细菌作用，在体内却发挥了抗菌作用，推测浙贝母主要通过调节机体免疫力来发挥作用；更为重要的是，治疗组与对照组相比，细菌清除率有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。

治疗组使用浙贝母后，细菌对环丙沙星的敏感性明显提高。

说明浙贝母具有逆转细菌耐药性的作用。

临床上渐贝母的用量一般在ｌＯ克左右，剂量偏小。

本研究表明：成年人每日服用浙贝母散剂３０９，无任何副作用。

但其最大用药剂量尚未确定，在临床上至少已有一个粗略的剂量标准可以借鉴。

（２）贝母素甲逆转作用研究。

联合药敏试验结果表明：ＰＨ．Ｈｄ地耐药菌均有不同程度的增敏作用，其增敏指数４～１５倍不等。

当贝母素甲终浓度在１５ｐｇ／ｍｌ～１２５１．ｔｇ／ｍｌ时，其增敏指数与剂量呈正相关；当终浓度大于１２５ｐｇ／ｍｌ时，随着浓度加大，其增敏作用
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无明显变化。

流式细胞仪测定结果显示：运用ＰＨ．Ｈｃｌ后，耐药绿脓杆菌内柔红霉素浓度最高，大肠杆菌次之，而金葡力最少。

其原因为，虽然ＰＨ．Ｈｃｌ对耐药绿浓杆菌增敏指数较小，但耐药绿脓杆菌对环丙沙星较敏感，耐药菌内环丙沙星浓度较高，使用ＰＨ．Ｈｃｌ后，使耐药菌内环丙沙星浓度进一步提高。

ＰＨ．Ｈｃｌ对耐药大肠杆菌和耐药金葡球菌增敏指数较大，但其本身对环丙沙星耐药倍数大，其耐药菌内柔红霉素浓度较小。

耐氟喹诺酾机制主要涉及药物作用的靶位改变和细菌的膜耐药，但临床分离菌更为复杂．往往同时涉及几种耐药机制。

从贝母素甲具有较为明显的逆转细菌多重耐药性的作用推测，贝母素甲除作用于耐药菌细胞膜上的主动外排系统外，可能同时作用于其他耐药机制。

这方面的研究工作将在今后继续进行。

参考文献
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Ｏｕｒｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｅｉｍｉｎｅｃａｌｌ１－ｅｖｅｉ－ｔｏｅＭＡＲｏｆｂａｃｔｅｒｉａ，ｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｅｆｌｕｘｐｕｍｐｏｆｂａｃｔｅｒｉａ．
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【作者简介】李仝，男，１９６６年生，籍贯河北。

在北京中医药大学获得博士学位。

研究兴趣：造血干细胞移植治疗血液病。

贝母素甲逆转细菌多重耐药性(MAR)的临床与实验研究
作者：李仝， 胡凯文， 孙颖立， 李英林作者单位：北京中医药大学第一临床医学院
本文链接：/Conference_5915176.aspx。