TLR4、SOCS3、miR-203在IgA肾病大鼠肾组织中的表达变化及意义

TLR4、SOCS3、miR-203在IgA肾病大鼠肾组织中的表达
变化及意义
肖俊;胡艳萍;涂露霞;魏昕;陈钦开
【摘要】Objective To observe the expression of toll-like receptor 4 (TLR4), cytokine signal transduction inhibitor 3 (SOCS3) and miR-203 in renal tissues of IgA nephropathy (IgAN) rat model, and to investigate its role in the pathogenesis of IgAN. Methods The experimental IgAN rat model was established by immune induction method. The kidneys of the rats were harvested at the 8 th and 9 th week of the model setting, and the renal tissue IgA expression was tested by immunofluorescence assay. The degree of glomerular mesangial hyperplasia was evaluated through the high Iodate-Schiff (PAS) staining. The expression of TLR4 and SOCS3 proteins were measured by western blotting, and the expression levels of TLR4 mRNA, SOCS3 mRNA and miR-203 were measured by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR).Results At the 8 th week of IgAN rat modeling, glomerular mesangial hyperplasia was observed. Comparing with normal controls, the expression of TLR4 and SOCS3 proteins and mRNA in kidney was significantly increased, and the miR-203 expression level was significantly elevated (P＜0.05). At the 9 th week of IgAN rat modeling, glomerular mesangial hyperplasia aggravated, the expression of TLR4 protein and mRNA did not change, but the expression of the SOCS3 protein and mRNA were significantly reduced the 8 th week (P＜0.05), but miR-203 expression was significantly increased (P＜0.05). Conclusion The
expression of TLR4, SOCS3 and miR-203 in renal tissues of IgAN rat model is increased, which may be related to IgAN pathogenesis, and the SOCS3 expression decreases with the increase of mesangial hyperplasia, suggesting that SOCS3 may play a protective role in IgAN.%目的观察IgA 肾病(IgAN)大鼠模型建立过程中Toll样受体4(TLR4)、细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)及miR-203在肾组织中的表达变化,初步探讨其在IgAN发病机制中的作用.方法 20只SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组和IgAN模型组,运用联合免疫诱导方法建立实验性IgAN大鼠模型,分别在建模第8、9周收获大鼠肾脏,免疫荧光检测肾组织IgA表达以验证模型成功建立,通过高碘酸-希夫(PAS)染色评价肾小球系膜增生病变,采用Western blotting免疫印迹法检测TLR4及SOCS3蛋白表达变化,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TLR4、SOCS3 mRNA及miR-203的表达变化.结果 IgAN大鼠模型建立第8周肾脏病理显示肾小球有系膜增生改变,与正常对照比较,肾脏TLR4、SOCS3蛋白及mRNA表达显著增加,miR-203表达水平也明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05);第9周肾小球系膜增生病变加重,TLR4蛋白及mRNA表达与第8周相比无显著变化,但SOCS3蛋白及mRNA 表达水平较第8周明显下降(P＜0.05),miR-203表达则较第8周升高(P＜0.05).结论 IgAN大鼠模型肾组织中TLR4、SOCS3、miR-203表达增加,可能与IgAN的发生发展有关,随着系膜增生病变加重SOCS3表达反而下降,提示SOCS3可能在IgAN进展中起保护作用.
【期刊名称】《广东医学》
【年(卷),期】2019(040)005
【总页数】5页(P631-635)
【关键词】IgA肾病;Toll样受体4;细胞因子信号传导抑制因子3;miR-203
【作者】肖俊;胡艳萍;涂露霞;魏昕;陈钦开
【作者单位】南昌大学第一附属医院肾内科, 江西南昌 330006;南昌大学第一附属医院肾内科, 江西南昌 330006;南昌大学第一附属医院病理科, 江西南昌 330006;南昌大学第一附属医院肾内科, 江西南昌 330006;南昌大学第一附属医院肾内科, 江西南昌 330006
【正文语种】中文
【中图分类】S941.42+7;R692.6
IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是由法国学者Berger等[1]首先描述和命名的，其主要特征是以免疫球蛋白IgA为主的免疫复合物在系膜区沉积，临床表现多样化，其中典型临床表现为黏膜感染后短暂时间内出现的肉眼血尿。

因此认为黏膜免疫异常与IgAN的发病机制有关。

天然黏膜免疫异常可能导致黏膜抗原清除障碍，使得炎症慢性化并持续分泌IgA。

Toll样受体4(TLR4)因其在先天性免疫和获得性免疫中的重要作用越来越受到关注。

近期研究表明TLR4可能通过多种机制参与IgAN的发生和进展。

但TLR4的调控因素尚不明确。

细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)作为一类典型的负向调节蛋白，对多种细胞因子信号转导起负反馈调控作用[2]。

生物信息学软件提示SOCS3是miR-203的潜在靶基因，miR-203可负向调控SOCS3。

2014年8月至2016年7月，本研究通过建立IgAN大鼠模型，观察TLR4、SOCS3及miR-203在肾组织中表达的动态变化，初步探讨TLR4、SOCS3、miR-203在IgAN中的作用及三者之间可能的调控关系。

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 20只SPF级雄性SD大鼠均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体重在150 g左右。

标准饲养1周后，随机分为正常对照组和IgAN模型组。

1.1.2 主要实验试剂及仪器牛血清白蛋白(BSA)、四氯化碳(CCl4)、脂多糖(LPS)均购于美国Sigma公司。

SOCS3一抗，TLR4一抗，FITC-IgA一抗(美国Abcam)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(中杉金桥)。

Real-timePCR试剂盒(美国Invitrogen)。

RM-2135型病理切片机(德国Leica)，BH-2型双目光学显微镜(日
本Olympus)，ABI Stepone plus荧光定量PCR仪(美国Thermo)，垂直电泳槽
及电泳仪(美国Bio-rad)。

1.2 实验方法
1.2.1 IgAN大鼠模型建立采用改良的联合免疫诱导方法建立实验性 IgAN大鼠模型，口服牛血清蛋白(BSA)400 mg/kg，隔天1次灌胃，共8周；皮下注射CCl4 0.1 mL，每周1次，共8周；在第6周末通过尾静脉注射LPS 0.05 mg；分别在建模第8、9周末收获大鼠肾脏。

正常对照组则采用同一时间、等体积的生理盐水灌胃，皮下注射以及尾静脉注射。

1.2.2 标本的获取及处理建模第8、9周末各组分别处死大鼠，通过10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取靠近肾脏皮质部分组织，一部分用冻存管保存在-80℃冰箱，一部分放入10%中性甲醛溶液固定后，用石蜡进行包埋，留待行PAS染色，一部分新鲜组织用于免疫荧光。

1.2.3 肾组织IgA免疫荧光大鼠肾组织用OCT包埋剂包埋后，通过低温切片机进
行切片，晾干洗涤滴加FITC标记的IgA抗体(1∶50稀释)，37℃孵育30 min后
洗涤，并用甘油封片，通过荧光显微镜，观察荧光亮度及面积。

1.2.4 肾组织PAS染色 10%中性甲醛溶液浸泡的组织通过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片拷片、切片脱蜡、 1%过碘酸水溶液浸泡、 Schiff氏试剂避光孵育、
Mayer 苏木素复染2 min、脱水透明封片等步骤，在显微镜下观察系膜细胞增殖
程度。

1.2.5 Western免疫印迹法检测肾组织中SOCS3、TLR4的表达取出大鼠肾脏组织，称取大约100 mg组织，用PBS清洗3次后用组织剪剪碎，加入RIPA裂解液。

采用组织超声波裂解组织。

通过BCA蛋白定量检测蛋白浓度，采用SDS-PAGE凝胶电泳，胶片扫描后使用Image J软件分析条带中的灰度值。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测肾组织中SOCS3、TLR4、miR-203的表达取出大
鼠组织，称取大约100 mg组织，用PBS清洗3次后用组织剪剪碎，放入研钵中，加入1 mL Trizol，并用液氮研磨。

根据Trizol方法步骤提取组织中RNA，采用
全式金逆转录试剂盒反转录成cDNA，根据Invitrogen公司PCR试剂盒进行荧光定量，所有引物设计由Invitrogen公司提供。

引物序列见表1。

1.3 统计学方法使用SPSS 17.0统计软件，计量资料数据以表示，采用t检验，
以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 免疫荧光检测两组肾组织IgA表达的差别通过免疫荧光技术，正常对照组未
见明显免疫荧光颗粒沉积，IgAN模型组在第8周末系膜区可见IgA成颗粒状、团块状沉积，提示建模成功；第9周末时荧光强度较第8周末进一步增强。

见图1。

2.2 PAS染色观察两组大鼠肾脏系膜细胞增生程度正常对照组肾小球系膜细胞及
基质无明显增生。

IgAN模型组在第8周末时出现肾小球系膜细胞轻-中度增生；
第9周末时出现肾小球系膜细胞中-重度增生。

见图2。

2.3 两组大鼠肾脏组织SOCS3及TLR4蛋白表达差异与正常对照组相比，IgAN
模型组SOCS3及TLR4的蛋白表达量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；IgAN模型组第9周SOCS3蛋白表达水平较第8周明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)；而IgAN模型组第8周与第9周TLR4蛋白表达量差异无统计学意义
(P>0.05)。

见图3、表2。

表1 引物序列及大小引物名称序列(5′-3′) 大小(bp)β-
actinF:CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC240R:TAAAGACCTCTATGCCAACA CAGTSOCS3F:CCAAGAACCTACGCATCCAG157R:TCCGTCGGTGGTAAAGAAA ATLR4F:TGCTCAGACATGGCAGTTTC212R:CTGGATTCAAGGCTTTTCCAU6F:C GCTTCGGCAGCACATATACR:AAATATGGAACGCTTCACGArno-miR-203a-
3pRT:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGT GGTF:TGCGCGTGAAATGTTTAGGACCR:CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT A：正常对照组；B：IgAN模型组第8周；C：IgAN模型组第9周图1 两组肾组织IgA荧光表达(免疫荧光,×400)
A：正常对照组；B：IgAN模型组第8周；C：IgAN模型组第9周图2 两组系膜细胞增生程度(PAS，×400)
1：正常对照组；2：IgAN模型组第8周；3：IgAN模型组第9周图3 两组SOCS3、TLR4蛋白免疫印迹电泳图
2.4 两组大鼠肾脏组织SOCS3及TLR4基因表达差异与正常对照组相比，IgAN 模型组SOCS3及TLR4的mRNA表达量均显著升高，差异有统计学意义
(P<0.05)；IgAN模型组第9周SOCS3的mRNA表达水平较第8周下降，差异有统计学意义(P<0.05)；IgAN模型组第8周与第9周TLR4的mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

见表3。

表2 两组SOCS3、TLR4蛋白表达水平的比较
组别SOCS3/GAPDHTLR4/GAPDH正常对照组0.33±0.020.27±0.04IgAN模型组8周0.86±0.01∗0.74±0.01∗IgAN模型组9周0.78±0.05∗△0.70±0.03∗
*与正常对照组比较 P<0.05；△与IgAN模型组第8周比较P<0.05
2.5 两组大鼠肾脏组织miR-203的基因表达量比较与正常对照组相比，IgAN模
型组miR-203的基因表达量明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，IgAN模型
组第9周miR-203基因表达量较第8周增加，且差异有统计学意义(P<0.05)。

见表3。

表3 两组SOCS3、TLR4、miR-203基因表达水平的比较
组别SOCS3TLR4miR-203正常对照组1.15±0.211.08±0.160.97±0.04IgAN模
型组8周4.61±0.09∗4.86±0.40∗1.18±0.04∗IgAN模型组9周
3.87±0.04∗△
4.51±0.14∗ 1.37±0.06∗△
*与正常对照组比较P<0.05；△与IgAN模型组第8周比较P<0.05
3 讨论
在以往的研究中，TLR4最突出的生物学功能是调控机体天然免疫及获得性免疫，在识别细菌LPS及介导的炎症反应信号转导中起重要作用。

由于黏膜免疫异常在IgAN发病机制中起重要作用，TLR4在IgAN中的作用日益受到关注。

Coppo等[3]发现IgAN患者外周单个核细胞(PBMC)中TLR4表达增加，且与尿蛋白及疾病活动时期相关。

Qin等[4]发现细菌LPS激活TLR4可以导致Cosmc的甲基化，从而降低IgA1的糖基化程度。

我们的前期研究也发现IgAN患者PBMC中TLR4表达量较正常对照组升高，可能参与IgAN的免疫发病机制，同时我们还发现IgAN 患者肾组织中TLR4表达也增高，且肾组织TLR4表达与系膜细胞增生、间质纤维化成正相关。

王缨等[5]发现IgAN大鼠肾组织中TLR4、髓样分化因子
88(MyD88)、核因子-κB(NF-κB)的表达增高，TLR4通路可能参与了IgAN的发
生发展。

其他动物体内研究[6-7]同样发现IgAN大鼠肾脏TLR4表达增高，使用TLR4抑制剂(TAK242)或大黄酸药物治疗后可下调TLR4的表达，改善血生化指标，减轻肾脏病理损伤。

可见TLR4信号通路的激活不仅在IgAN全身免疫紊乱中起作用，也参与了IgA沉积后一系列肾脏局部损伤反应。

在本研究中，我们也观察到
通过免疫诱导法建立IgAN大鼠模型，在第8周时肾组织TLR4表达水平已显著升
高。

同时我们还发现SOCS3在IgAN大鼠肾组织中表达明显增高，这与我们前期研究中观察到SOCS3在IgAN患者肾组织表达增多的结果是相一致的。

SOCS3在细胞因子及免疫抗原诱导的瀑布效应中起着非常重要的作用，可以调控
多种细胞因子及信号传导通路，与各种疾病(糖尿病、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病、过敏性疾病及生殖疾病等)有关，有可能成为疾病诊断及评估预后的分子指标，或成为特定疾病的治疗靶点[8]。

众多研究表明，SOCS3参与了肾脏病理生理的调控，包括免疫炎症反应、系膜细胞增殖、肾小管上皮细胞转分化及肾纤维化等[9-10]。

在糖尿病肾病大鼠模型中，通过上调SOCS3表达，可显著改善肾功能并减
少肾脏系膜细胞增生及间质纤维化损伤[11]。

但SOCS3在IgAN中的作用鲜见报道。

我们在前期工作中发现SOCS3在IgAN患者肾小球、肾小管间质中均表达增高，且SOCS3表达水平与肾脏病理损害指标呈负相关，推测SOCS3可能对
IgAN肾损伤起保护作用。

通过体外实验，我们发现上调SOCS3表达可抑制
IgAN患者aIgA1刺激诱导人肾小球系膜细胞TLR4的表达，从而抑制系膜细胞增殖[12]。

SOCS3对TLR4信号通路的调控作用目前仍有争议。

多数研究认为SOCS3对
TLR4的调控是负向调节。

Hilberath等[13]发现SOCS3可减轻急性肺损伤中
TLR4介导的氧化应激反应。

一项针对糖尿病视网膜病的研究结果显示，上调SOCS3可以通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻视网膜胶质细胞的炎症反应[14]。

而Liu等[15]则认为SOCS3是TLR4信号通路的正向调节子，它是通过反馈抑制TGF-β1/smad3通路而发挥其正向调节作用的。

在本研究中我们发现随着IgAN
大鼠建模时间的推移，肾脏系膜细胞的增生病变加重，肾脏SOCS3的表达反而呈下降趋势，因此我们推测IgAN早期免疫因素诱导TLR4的表达增加，继而启动SOCS3的负反馈调节，但后期SOCS3表达下降，未能维持对免疫炎症诱发肾损
伤的抑制作用，因而没有阻止IgAN的进程。

但抑制SOCS3表达的机制尚不明确。

生物信息学软件预测提示SOCS3基因3′UTR存在miR-203结合位点。

许多研究也表明SOCS3是miR-203的靶基因。

Ru等[16]发现沉默miR-203可上调乳腺
肿瘤细胞SOCS3的表达。

Navarro等[17]在原发性血小板减少症患者中发现
miR-203与其靶基因SOCS3表达呈负相关。

在本研究中我们发现IgAN大鼠肾组织中miR-203表达增加，随着建模时间延长miR-203进一步升高，正好与SOCS3变化相反，由此我们推测miR-203表达的持续增高，可能负调控SOCS3水平，抑制了SOCS3对肾脏的保护作用，使得TLR4介导的肾脏炎症反应及系膜细胞增生病变加重。

通过本研究，我们证实了TLR4在IgAN发生发展中的促进作用，初步揭示了SOCS3对IgAN肾损伤的保护作用，以及miR-203对SOCS3可能的调控作用。

当然三者在IgAN中的确切作用及三者间的相互关系仍有待更深入的研究证实。

以SOCS3为靶点，寻求上调其表达的途径，以抑制炎症反应、细胞增殖等病理损害，将为IgAN的治疗提供新的方向。

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