植酸酶活性测定

饲用植酸酶活性的测定
分光光度法
1范围
本标准规定了以分光光度法测定饲用植酸酶活性的方法。

本标准适用于作饲料添加剂用的植酸酶产品，也适用于添加有植酸酶的配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。

样品最低检出量为90U／kg。

2 引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。

本标准出版时，所示版本均为有效。

所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准的最新版本的可能性。

GB／T 6682—1992 分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696：1987)
3 植酸酶活性单位定义
样品在植酸钠浓度为5.0 mmol／L、温度37℃、PH值5.00的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

4 方法原理
植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·16MoO3]复合物，在波长415nm 下进行比色测定。

5 试剂和溶液
本标准中所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和符合GB／T 6682中规定的三级水。

清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。

5.1 0.25mol／L 乙酸缓冲液(I)
称取34.02g三水乙酸钠于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。

5.2 0.25mol／L乙酸缓冲液(Ⅱ)
称取34.02g三水乙酸钠，0.5g TritonX-100,0.5g牛血清白蛋白（BSA）于1000mL容量瓶中，加入900mL水溶解，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，并用蒸馏水定容至1000mL，室温下存放2个月有效。

5.3 7.5mmol/L植酸钠溶液 c(C6H6O24P6Na12)为7.5mmol／L
称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12)于100mL。

容量瓶中，用0.25mol／L乙酸缓冲液(5.1)溶解并定容至刻度，用冰醋酸调节pH至5.00±0.01，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0 mmol／L)。

5.4 硝酸溶液：1+2水溶液。

5.5 100g／L钼酸铵溶液
称取10g钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]于100mL。

容量瓶中，加入1.0mL氨水(25％)用水溶解定容至刻度。

5.6 2.35 g／L钒酸铵溶液
称取0.235 g钒酸铵(NH4VO3)于100mL棕色容量瓶中，加入2 mL硝酸溶液(5.4)，用水溶解定容至刻度。

避光条件下保存一周有效。

5.7 颜色终止液
移取2份硝酸溶液(5.4)，1份钼酸铵溶液(5.5)，1份钒酸铵溶液(5. 6)混合后使用，现用现配。

(注意：不要有白色乳状沉淀，加硝酸要慢)
5.8 植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)。

5.9 磷酸二氢钾(KH2PO4)：基准物。

6 仪器和设备
6.1 实验室常用仪器设备。

6.2 恒温水浴：(37±0.1)℃。

6.3 分光光度计：有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。

6.4 磁力搅拌器。

6.5 涡流式混合器。

6.6 酸度计：精确至小数点后2位。

6.7 离心机：转速为4000r／min以上。

7 试样制备
取有代表性样品，用四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。

8 测定步骤
8.1 绝对法(仲裁法)
8.1.1 标准曲线
准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾(5.9)于100mL容量瓶中，用乙酸缓冲液(5.2)溶解，并定容至100mL浓度为50.0mmol／L。

按表1的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程(y ＝ax+b)。

表1
8.1.2 试样溶液的制备
按照附录A中建议的称样量称取试样两份，精确至0.0001 g，置于100 mL容量瓶中，加入约70mL乙酸缓冲液(5.2)﹡，一个磁力棒，在磁力搅拌器(6.4)上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(5.2)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。

摇匀，在离心机(6.7)上以 4 000r／min离心10min。

分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(5.2)稀释（一般取2ml上清夜到50ml 容量瓶中），使样液浓度保持在0.4U／mL。

左右，待反应。

建议在测定样品时附加一个已知活性的植酸酶参考样，便于检验整个操作过程是否有偏差。

﹡以玉米芯、麸皮等为载体时可提高缓冲液5.2中TritonX-100及BSA 的浓度至0.5% 8.1.3 反应
取10mL 试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(5.3)开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min 。

反应步骤及试剂、溶液用量见表2。

表2
8.1.4 样品测定
反应后的试样在室温下静置10min ，如出现混浊需在离心机(6.7)上以4 000r ／min 离心10min ，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计(6.3)415 nm 波长处测定样品空白(A 。

)和样品溶液(A)的吸光值，A-A 0。

为实测吸光值。

用直线回归方程计算植酸酶的活性。

9 结果计算和表示
9.1 计算公式
试样中植酸酶的活性,用每克(或ml)试样中的活性单位“U”表示, 计算公式如下： 9.1.1 绝对法 U ＝F m c
⨯⨯30
．
．．．．．．．．．．．．．．．(1) 式中：
U ——试样中植酸酶的活性，U ／g
C ——根据实际样液的吸光值由直线回归万程计算出的x 值，U ； F ——试样溶液反应前的总稀释倍数。

m ——试样质量，g 或mL 30——反应时间，min 9.2 结果表示
两个平行样品的测定结果用算术平均值表示，保留整数。

9.3 重复性
同一样品两个平行测定值的相对偏差，植酸酶产品不大于8％，添加植酸酶的各种饲料样品不大于10％。

附录 A
(提示的附录)
建议称样量
根据样品植酸酶活性的不同，建议称样量见表A1。

表A1。