酵母扩培工艺

酵母扩大培养工艺
1、目的
规范酵母扩培作业程序，有效控制扩培工艺参数，保证培养酵母质量均一、稳定。

2.适用范围
适用于实验室、酿造车间现场扩培和锥罐扩培工序。

3.职责
由公司技术处负责编制、修改，实验室和酿造车间负责实施。

4.规定内容
4．１实验室培养
4．1.1培养基制备流程
４.1．1．1取１2度生产定型（热或冷)麦汁,调整pH至5.3-5．5,进行稀释，稀释比例以最终煮沸浓度控制在1２度为准。

4.1.1.2稀释后麦汁冷却（或加热)至40℃按每升2个蛋清搅至起泡后打入。

升温
至60℃保温3０分钟,保温结束后升温至１0０℃煮沸３0分钟。

4．1．1.3检测调整浓度后过滤、分装入试管、小三角瓶、大三角瓶, 0.07Mpa 灭菌30分
钟。

４.1.1.4灭菌后培养基要贴有制备日期标签，空培(室温放置）3天以上确认无菌后方可使用。

４.1.１．5卡氏罐培养基制备采用过滤后热麦汁装入清洗并经0.1０Mpa蒸汽杀菌1 小时后的卡氏罐中0.10Mpa灭菌30分钟,提前1－2天完成，确保接种温度稳定。

当天能够迅速冷却的,则取当天麦汁处理，冷却后接种。

4.1．２无菌室卫生操作流程
４．1．2．1每天对室内进行３0分钟紫外杀菌。

超净台用前提前打开风机及自带的紫外灯灭菌３０分钟。

4.1.2.２无菌操作前对无菌室进行全面彻底清洁。

地面、墙壁、天棚及空间采用
甲醛熏蒸或75%酒精擦试。

同时用紫外杀菌3０分钟。

4．１.2.３卡氏罐接种，超净台无法操作时,室内空间当天再次进行上述空间杀菌。

4.１.２.4无菌室内应避免其他物品的摆放,尤其操净台面。

以免破坏空气层流。

４.1.2.5每次扩培时应对无菌室内空间及超净台进行两次空气捕捉检测。

斜面接出及卡氏罐接种时各进行一次。

４.１.3实验室阶段扩培工艺流程
１.安培管(或斜面菌种)在无菌条件下,接入装１0ml麦汁培养液的18×180ｍm试管中,在25℃培养箱中活化培养24小时(如从安培管转接，需再活
化一次).
2.将活化后的试管培养液摇均，在无菌条件下,分别接1ml入装1０ml麦汁培养液的
1８×1８0mm试管中,在２5℃培养箱中培养活化2４小时.
3.将试管中的1０ml酵母培养液转接到装５0mｌ麦汁培养液的150ｍl三
角瓶中, 在22℃培养箱中培养２４小时．
4.将三角瓶中的５0ml酵母培养液转接到装５00ml麦汁培养液的10０0ml
三角瓶中，在１9℃培养箱中培养24小时.
5．将三角瓶中的500ｍl酵母培养液转接到装30０0ｍｌ麦汁培养液的
5000ｍl三角瓶中, 在19℃培养箱中培养24小时．
6.将三角瓶中的3００0ｍl酵母培养液转接到装２5L麦汁培养液的卡氏罐,
在１３℃培养箱中培养24小时~48小时．
7.将卡氏罐中的酵母培养液转接到装300L麦汁培养液的汉生罐（种子罐）,
在1３℃条件下培养24小时~４８小时.
4.1.3.1斜面菌种挑取应在距离斜面顶部１/３处边缘部位轻挑一菌耳。

液体管之
间的活化过程采取用无菌吸管吸取0.5ml注入10ml液体管内，其他接种
方式为全部到入(对瓶口粘培养液的用火烤干再塞盖）。

4.１.3.2对采用软管连接进行接种时，乳胶管能够进行拉刷刷洗时进行拉刷清洗,
用前连同罐一同蒸汽杀菌或采取１05℃干热灭菌3０分钟后放无菌室备
用，为防止胶管老化,定期更换。

不能采取拉刷刷洗时,水冲洗后用75%
酒精进行浸泡备用。

连接管路进行蒸汽杀菌。

4.2现场培养
4.2．１ＣIP刷洗程序
４．２.1.１罐体碱刷洗：清水冲洗（其中包括能走碱水部分)无沫后,采用片碱熔化后配成2～3%、不低于７０℃碱液循环清洗罐体30分钟.
4.2．1.2清水冲洗：清水冲洗20分钟(走碱部分),最后以PH试纸中性为准。

4.2.１．3酸洗:清水冲洗后,用１.0-１.5％的磷酸循环刷洗一次，方法同碱液刷
洗。

4.2.1．4清水冲洗：清水冲洗２0分钟（走酸部分)，最后以PH试纸中性为准。

注：以上清洗以无酸、碱残留为准（最终以ＰＨ试纸中性为准)。

4.２.1．４扩培锥罐执行车间锥罐CIP刷洗工艺。

4．2.２蒸汽杀菌
4.２．2.1罐体及管路、风过滤器包蒸汽杀菌
罐体及管路采用105~110℃杀菌３０分钟,其中包括冲氧管、备压管杀菌、风过滤器包杀菌，杀菌结束后保压备用并用无菌风将风过滤器包吹干。

罐
体杀菌时排气阀、取样阀及管盘接口排放蒸汽保证杀菌20分钟。

麦汁、
倒酒管路采用1０5～11０℃杀菌20分钟。

4．2.２.２麦汁杀菌
汉生罐、扩大罐麦汁采用热麦汁,升温至100℃保温３0分钟，保温结束
后保压降温至接种温度,接种前通风搅拌２分钟，锥罐采用大生产冷麦汁。

4.2.3扩培工艺流程（暂行)
卡氏罐（２5L）→汉生罐（0.3ＫL１5．0℃）———→扩大罐(3KL13.0℃）
↓
汉生罐(0.３KL1５.0℃）
↓
１00吨罐5０KＬ１0℃←锥罐35ＫＬ１1℃←锥罐12ＫL11℃←扩大罐（3KL1３．0℃）
锥罐追加12KＬ后，当酵母数达到300０-4０00万个/ｍl后追加35KL麦汁;
当酵母数达到３000－4０00万个/mｌ后4小时之内追加麦汁，满罐温度1０℃。

注：1.麦汁浓度采用1２度麦汁。

4.3保种
汉生罐迅速冷却至2-4℃保种,一次保种≤10天。

4．4其他要求
4.4．1 各级扩培罐倒空后立即清洗,清洗结束背压，超过４８小时重新进行清洗,
接麦汁前进行蒸汽杀菌。

４．4．2灭菌麦汁冷却后存放时间不超过6小时,冷麦汁不超过2小时。

4．4.3各级扩培酵母数应提前预测，达到工艺标准后追加麦汁时间不超过２小时。

4.４.4风（蒸汽）滤芯清洗、更换。

绝对精度0.01－0．02um滤芯一年内更
换一次无菌风滤芯（以实际微检情况为准并参照使用说明）,粗滤、精滤及蒸汽过滤滤芯每月拆卸刷洗一次。

4．4.5扩培过程每罐酵母液进行微生物检验：细菌总数。

过滤后风系统每3天检测一次细菌总数。

每一批菌种接种前的冷麦汁检一批次。

４．5培养过程酵母检测方法(包括锥罐酵母)个/ml
4．5.1 酵母数和出芽率测定方法
取洁净的血球计数板，在计算室上面加一个盖玻片,将被测的酵母菌悬浮液摇匀,用洁净的玻璃棒取少许，从盖玻片的边缘滴一滴, 使菌液自行渗入,计算室内不得有气泡,静置放一会,在600倍显微镜下观察,计算:即5个中格的细胞总数(•包括出芽细胞）和出芽的细胞数,计算方法以“计上不计下,计左不计右”为原则。

注：计算酵母数时,当细胞(芽)大于或等于母细胞1／2时,该细胞不算出芽,•而算两个
细胞,当子细胞(芽)小于母细胞的1/2时, 该细胞算作出芽的一个细胞.
4.5.2 酵母死亡率测定方法
４.5.2.1０．01%美兰试剂配置：取0.010g美兰溶于10mｌ蒸馏水中,加2．0克二水柠檬酸
搅拌溶解,再用蒸馏水定容至100mｌ.每3个月更换一次。

4.5.2.２死亡率测定:在洁净的血球计数板计算室上加盖盖玻片，取摇匀后待检样
品于盖玻片边缘滴入,菌液自行渗入后同法滴入0.０1%美兰一滴,与之混
合后在60０倍显微镜下观察细胞着色情况,已柒成兰色的为死细胞,计算
死细胞占总细胞百分率.
培养液、酵母泥检测细胞总数不少于500个。