青霉素种子罐工艺影响因素的研究

青霉素种子罐工艺影响因素的研究
任崇莲1, 2 王凤山1*
（1. 山东大学药学院，山东 济南 250012；2. 鲁南制药集团股份有限公司， 山东 临沂 276000）
摘 要：目的 研究青霉素种子罐工艺的影响因素。

方法 以产黄青霉菌突变株Penicillium chrysogenum 8621为实验菌种，优化种子罐培养工艺条件。

结果 获得了种子罐培养的最佳控制条件与最适移种时机。

结论 使用优化后的工艺条件，该菌株发酵生产青霉素的最终发酵效价提高了5 %。

关键词：产黄青霉菌；青霉素；发酵；种子；优化
中图分类号：R978.1+1 文献标识码：A 文章编号：1672-979X(2010)11-0415-04
收稿日期：2010-03-22
作者简介：任崇莲（1976-），女，山东临沂人，工程师，从事生物制药研究 E-mail ：ren2007-1@
*
通讯作者：王凤山，男，教授 E-mail ：fswang@
Experimental Study on Influencing Factor of Penicillin Fermentation Production in Seeding
Tank
REN Chong-lian 1, 2, WANG Feng-shan 1
(1. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Lunan Pharmaceutical Group
Co., Ltd., Linyi 276000, China )
Abstract: Objective To research the influencing factor of penicillin fermentation production in the seeding tank. Methods Using Penicillium chrysogenum 8621 as the experimental strain, the fermentation technology in the seeding tank was optimized. Results The best control condition and the optimal time for transplanting of the strain culture in the seeding tank were obtained. Conclusion The fermentation titer of penicillin produced by Penicillium chrysogenum 8621 can be increased by 5 % using the optimized condition.
Key Words: Penicillium chrysogenum ; penicillin; fermentation; seed; optimization
控制青霉素发酵过程是指在测量生产菌的环境条件和代谢变化参数的基础上，结合代谢调控基础理论，使生产菌沿着最佳轨迹代谢变化，实现以较低的能量和物料消耗生产更多的青霉素[1]。

提高青霉素生产水平，一要不断优化发酵工艺技术，二要筛选生产菌种。

优良菌种影响发酵全过程较大，是提高青霉素发酵效价的基础。

本研究选择30 m 3通用型发酵罐作为种子罐，在原有工艺基础上使用Penicillium chrysogenum 8621进行进罐实验。

根据青霉素种子生长过程调整工艺，摸索种子罐培养工艺的最佳条件。

1　材料1.1 实验材料
菌种 Penicillium chrysogenum 8621（鲁南制药菌种选育中心）；蔗糖（食用级，广西凤糖）；玉米浆（工业级，华北制药）；硫酸铵、碳酸钙（分析纯，天津恒兴）；玉米油（食用级，金龙鱼公司）。

培养基 组成（g/L ）：蔗糖12，玉米浆75，碳酸钙10，玉米油0.8，硫酸铵3.5；配制方法：称量培养基各原料，投入种子罐，加纯化水，开启搅拌充分混合溶解，先按80 %定容，加30 %氢氧化钠溶液调pH 6.10，定容。

1.2 设备
BX-30JS 通用型发酵罐（上海保兴）。

2 方法2.1 培养条件
灭菌后培养基pH 6左右；接种量：1.4亿米孢子/m 3；罐温：25~26 ℃；罐压：0.04~0.06 MPa ；通气比1.3；周期70~75 h 。

2.2 菌丝浓度测定
取摇匀的发酵液10 mL 置于刻度离心管中，3 000 r/min 离心10 min ，静置后读取菌体所占体积，该体积数值的1/10 即菌丝浓度。

2.3 青霉素含量测定
用剩余碘量法[2]检测摇瓶效价。

准确吸取离心后发酵液的上清，然后按摇瓶效价的高低分别稀释成不同的倍数。

再取样品置入2个碘瓶中，分别作为空白和样品。

2.4 米孢子数计数
取1瓶250 mL 茄子瓶装的小米培养基的米孢子（小米25 g ），全部倒出，用水定容至2 000 mL ，搅匀，用规格25～16格的血球计数板在显微镜下计数，计四角和中间5个中格的孢子数，所得数据即为每瓶米孢子的亿数。

2.5 采用最初工艺种子罐培养
最初发酵工艺为：（1） 种子罐配方（g/L ）：蔗糖12，玉米浆75，碳酸钙10，玉米油0.8，硫酸铵3.5；（2） 种子罐的灭菌后体积：约24 m 3；（3） 接种孢子量：每立方米1.4亿以上；（4） 过程控制：温度25~26 ℃，压力0.05~0.06 MPa ，通气量1∶3；（5） 移种条件：菌丝浓度70 %，周期60~65 h ，pH 值达最低点5.60时移种。

按上述条件运行，种子罐的过程表现为：50 h 前菌丝生长代谢较缓慢，pH 变化不剧烈，菌丝浓度30 %~50 %；50 h 后pH 值加速下降，菌丝浓度加速上升，60~65 h 时，pH 降至5.6左右，菌丝浓度达到65 %。

分析种子罐代谢情况，要控制菌丝数量，防止菌丝过度分化，需熟练掌握影响种子罐的各种因素，找出最佳移种时机。

2.6 种子罐工艺的优化试验
2.6.1 孢子接种量对种子生长的影响 在培养条件和控制条件相同的情况下，用不同的孢子接种量，观察和检测移种于发酵罐时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的孢子接种量。

2.6.2 种子罐罐压对种子生长的影响 在孢子接种量相
表1 孢子接种量对种子罐的影响
批次孢子接种量/亿·m -3
生长周期/h pH 菌丝浓度/%发酵罐效价/U ·mL -11 1.0770 6.7171798542 1.4068 6.66697325030.9274 6.59687669040.8575 6.5065726865
1.01
72
6.68
70
78520
同、培养条件相同的情况下，调整种子罐的罐压，观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的罐压。

2.6.3 温度对种子生长的影响 在孢子接种量相同、培养条件和控制条件相同的情况下，调整种子的培养温度，观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的培养温度。

2.6.4 培养基浓度对种子生长的影响 在孢子接种量与培养条件相同的情况下，通过降低培养基灭菌后的体积即增大培养基的浓度，观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化，根据最终的发酵结果，确定合适的培养基体积。

2.6.5 种子罐移种条件的确定 种子罐的移种标准即种子的最佳状态为：菌丝舒展、粗壮，菌丝浓度70 %左右，pH 值约5.60。

3 结果与分析
3.1 种子罐工艺的优化
3.1.1 孢子接种量对种子罐的影响 孢子接种量是影响下一级发酵生产代谢的重要因素。

接种量过大必然加剧孢子在发芽、生长、繁殖过程中对营养物质和溶氧的竞争，导致种子液中由于菌丝体数量多、营养不足而老化断裂、发酵活性差。

孢子接种量、典型种子罐生长速度相关的数据和最终发酵数据见表1。

由表1可见，接种孢子数在1.0 亿/m 3左右时，发酵效价最高；小于1.0 亿/ m 3时，种子罐中菌体生长相对较慢，生长周期长；大于1.0 亿/ m 3时，种子罐中菌体生长相对较快，生长周期短，但两种情况下发酵效价均低于1.0 亿/ m 3左右时，发酵效价比孢子接种量1.4 亿/ m 3时提高了9.0 %。

3.1.2 种子罐罐压对菌种生长的影响 就耗氧发酵而言，溶氧水平是决定发酵成功的关键因素之一。

在种子罐原控制工艺的基础上，用分段控制方法，即前40 h
降低罐压为孢子提供较低压环境，加快孢子发芽和生长速度；40 h 后提高罐压以抑制菌丝生长过快。

调整前后典型种子罐的相关数据和最后发酵结果的据见表2。

由表2可见，降低种子罐前期的培养罐压，可以延长种子罐的生长周期，菌丝浓度相应增加，种子质量和发酵水平有较大幅度的提高。

因此在种子培养过程中，分段控制种子罐的罐压：前40 h 为0.06 MPa ，40 h 后为0.10 MPa 。

发酵效价提高了4.2 %。

3.1.3 温度对种子生长的影响 微生物自身的酶系统活力在最适温度范围内才得以最大发挥[3]，温度是影响微生物生长发育及代谢活动的重要因素。

青霉素发酵温度一般为25~26 ℃，分别用25℃和26℃两种温度的种子罐培养，考察温度对新菌种生长代谢速度的影响，结果见表3。

由表3可见，种子罐合适的培养温度为25 ℃。

生长周期相同（72 h ），26 ℃培养条件生物量高于25 ℃。

因此生产时，可通过提高种子罐培养温度促进菌丝分化和生长。

生长过快时，可适当降低培养温度抑制菌丝生长[4]，以确保移种的最佳周期和发酵罐的高效价。

3.1.4 培养基消后体积对种子生长的影响 培养基成分的选择、配比与组合直接影响产生菌的生长发育和最终发酵单位。

种子培养过程中既要保证菌体生长所需营养成分的适量供给，还要适当提高培养基中基质浓度以避免菌丝过早分化。

在种子罐的培养基配料不变的情况下，将30 m 3种子罐消后体积由24 m 3降低为22 m 3，相当于提高了培养基营养成分的浓度，30 m 3种子罐消后体积调整前后，典型种子罐与生长速度相关的数据以及最后的发酵结果见表4。

由表4可见，在种子罐配料量不变的情况下，降低灭菌后体积，相应地丰富了培养基的营养成分，控制了菌体的生长速度，延长了种子罐的生长周期，避免了菌丝过度分化，提高了生物量和种子质量。

同时发酵效价提高了3.4 %。

3.1.5 种子罐移种条件的确定 通过研究种子罐工艺，对菌种种子罐的代谢有了进一步认识。

种子罐前期的孢子要从休眠状态逐渐苏醒、吸水膨胀、萌发，这个过程基本不消耗养分，所以基本不会影响种子液的pH 值。

随着孢子发芽、菌丝形成，菌丝的生长代谢
产生酸性物质，pH 值逐渐下降。

随着菌丝的繁殖生长，种子液黏度增大，菌丝浓度上升，利用碳源的同时消耗氧，所以溶氧量随着下降。

当培养基中碳源浓度低于支持菌丝继续生长时，由于菌丝生长旺盛，即使调节通气量，因黏度太大溶氧量达到低值，pH 达到最低值[5]，菌丝浓度也达到相对稳定值。

随着碳源耗竭，溶氧有所回升，菌丝开始利用玉米浆中氨基酸等有机物中的碳源生长，菌丝浓度继续增加，溶氧又开始下降，随着氨基酸等有机碳源的利用，有机物中结合的氨氮释放，导致氨氮上升、pH 上升，菌丝出
表2 种子罐罐压对菌种生长的影响
表3 不同温度对菌种生长的影响
孢子接种量/亿
·m -3
40 h 前罐压/MPa
40 h 后罐压/MPa
种子罐移种周期/h
种子罐移种pH 值
菌丝浓度/%发酵效价/ U ·mL -1
调整前 1.060.100.1068 6.586878 665调整后
1.06
0.06
0.10
72
6.35
70
81 980
温度/℃孢子接种量/亿·m -3
pH 生长周期/h
菌丝浓度/%
发酵效价/ U ·mL -1
25 1.06 6.40726781 09026
1.06
6.55
71
70
80 745
表4 种子罐消后体积调整前后生长速度对比
灭菌后体积/m 3
孢子接种量/亿·m -3
生长周期/h
移种pH 值移种菌丝浓度/%
发酵效价/ U·mL -1
调整前24.0 1.0670 6.606875 390调整后
22.0
1.06
72
6.40
71
77 958
204060801001200 30 40 5054586062 64 66 68 707275
5
5.25.45.65.86
6.26.46.66.87
生长周期/h
图1 种子罐中溶氧量、生物量和pH 值变化曲线图
现分化趋势进入对数生长期，这时种子罐种子具备了移种条件。

根据这一代谢规律绘制了种子罐中种子的代谢曲线，见图1。

根据菌种Penicillium chrysogenum 8621在种子罐发酵过程中表现出的特性，该菌种的菌丝充分分化，pH 明显回升时，即种子处于生长的稳定期，此时是移种的最佳时期，到达此时所需的时间称为种子罐的最佳培养周期。

结合种子罐的基本代谢规律和标准代谢曲线，最终确定种子罐的移种条件为：（1） 最佳培养周期72 h 左右；（2） 种子液pH 值从最低点回
表5 种子罐工艺调整前后对比
孢子接种量/亿·m 3
罐压 /MPa 生长周期/h
pH 生物量 /%
消后体积/ m 3
培养温度 5批平均效价
/℃ / U·mL -1
调整前 1.40.05~0.0668 6.50652425~26 78 095调整后
1.06
前40 h 0.06，后40 h 0.1
72
6.40
70
22
25 81 801
升至6.40以上时；（3） 种子液pH 开始回升约5 h ；（4） 菌丝浓度达到70 %以上。

3.2 重复试验
围绕确定合适的移种条件，依据实验所得数据，种子罐工艺调整前后变化见表5。

由表5可见，种子罐发酵工艺的最优条件为：（1） 接种孢子量1.0 亿/m 3；（2） 罐压采取分段控制，前40 h 罐压0.06 MPa ，40 h 后0.10 MPa ；（3） 种子罐最佳培养温度25 ℃；（4） 消后体积降低8 %左右；（5） 移种pH 控制在6.40；（6） 生长周期即最佳移种时间控制在72 h 。

根据调整后的种子罐工艺，5批重复试验平均发
酵效价比调整前提高了5.0 %左右。

参考文献
[1] 张嗣良，储炬．多尺度微生物过程优化[M]．北京：化学工业
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[5] 贺小贤．生物工艺原理[M]．北京：化学工业出版社，2003：4．
本刊采用“中华人民共和国法定计量单位”，如：物质的量浓度c （M r 或A r 已准确测得时）及其单位mol/L ，mmol/L ，μmol/L 等；或质量浓度ρ（混合物或M r 、A r 未准确测得时）及其单位g/L ，mg/L ，μg/L 等。

组合单位符号中的斜线只限 1条，如 mg/kg/d 应改为 mg/(kg • d)。

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图和表均应有序号和题名。

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