肝糖原的提取和鉴定

肝糖原的提取和鉴定
一、实验目的
1、学会和掌握肝糖原提取和鉴定的原理和方法。

2、正确掌握使用离心机的方法步骤。

二、实验原理
三、实验步骤
（一）、肝糖原提取
1、用脱臼法处死白鼠，立即取出肝脏，迅速以滤纸吸取附着的血液。

称取肝组织约2g，
置研钵中，加入10%三氯乙酸2ml，用剪刀把肝组织剪碎，再加石英砂少许，研磨5min。

2、再加5%三氯乙酸4ml，继续研磨1min，至肝脏组织已充分磨成糜状为止，转入离
心管，然后以2000r/min离心10min。

3、小心将离心管上清液转入另一个离心管中，加入同体积的95%乙醇，混匀后，此时
糖原成絮状沉淀析出。

4、溶液以2000r/min离心10min。

弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上1~2min。

5、在沉淀内加入蒸馏水2ml，用细玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即成糖原溶液。

（二）、鉴定
1、取2支小试管A、B，一支A加糖原溶液10滴，另一支B加蒸馏水10滴，然后在
两管中各加碘-碘化钾溶液1滴，混匀，比较两管溶液颜色有何不同。

2、再取2支小试管，将剩余的糖原溶液平分倒入两试管，试管甲加浓盐酸3滴，试管
乙加蒸馏水3滴，将两管在沸水浴中加热10min以上。

取出冷却，试管甲中逐滴加入20%NaOH溶液，并且PH试纸检验，直至溶液成中性。

试管乙中加入同等滴数的蒸馏水。

3、向甲、乙两试管各加入班氏试剂2ml，再置沸水浴中加热5min，取出冷却。

观察有
无沉淀生成。

注意事项：
1、实验小白鼠在实验前必须饱食。

2、脱臼法处死小白鼠：手提着小白鼠将其小白鼠尾巴将其从笼子里取出，使其四脚着地，
另一支手按着小白鼠耳后，尾巴向外拉，使其脊柱断节，背部脊髓断裂，致使四肢瘫痪。

3、肝脏离体后，所得肝脏必须迅速以三氯乙酸处理。

4、研磨应充分，这是实验成败的关键。

5、离心时与另一组同学的离心管平衡，对称放入离心机。

6、鉴定的第（2）步，试管甲中溶液必须调至中性或偏碱性。

四、实验结果
试管A 试管B
棕红色黄色
试管甲试管乙
砖红色沉淀无沉淀
分析：
1、实验小白鼠在实验前必须饱食，因为空腹时，血糖含量降低，肝糖原分解来提高血
糖含量，肝糖原含量易于减少或耗尽。

2、吸去肝脏附着的血液，可能是血液中含有还原性的葡萄糖，会影响后面糖原的鉴定。

3、肝脏离体后，肝糖原会在酶的作用下迅速分解。

所以肝脏必须迅速以三氯乙酸使蛋
白质变性以防其分解。

4、研磨应充分，研磨使细胞破裂，肝糖原释放出来。

研磨不充分会得不到糖原或含量
很少，影响后面的鉴定。

加石英砂利于研磨。

5、经第一次离心，蛋白质会沉于离心管底部糖原则留于溶液中。

（上清液中）。

6、糖原不溶于乙醇溶液，所以加入同体积的95%乙醇，混匀后，糖原会成絮状沉淀析
出。

浑浊程度反映了糖原的多少。

越浑浊，糖原越多。

7、经第二次离心，糖原沉于离心管底部，糖原微溶于水，所以在加入蒸馏水后，沉淀
会在搅拌下溶解成糖原溶液。

8、糖原为高分子化合物，与碘作用呈棕红色，所以试管A出现棕红色溶液。

试管B
中为水，加入碘-碘化钾后，将仍为碘-碘化钾溶液的颜色，黄色。

9、糖原无还原性，不会与班氏试剂在沸水浴中生成砖红色的Cu2O沉淀，所以试管乙
中仍为班氏试剂的颜色，蓝色，无沉淀。

10、糖原会在浓盐酸在沸水浴下分解成小分子化合物，其中有还原性的麦芽糖和葡
萄糖。

还原性糖会在碱性条件下，班氏试剂与其在沸水浴下生成砖红色Co2O沉淀。

班氏试剂为碱性溶液，所以须用20%NaOH溶液中和至中性。

所以试管甲中会出现
砖红色沉淀。

11、班氏试剂中有CuSO4，NaCO3和柠檬酸钠。

CO32-提供碱性环境，柠檬酸钠
为络合物，帮助Cu2+与葡萄糖反应，沸水浴下，Cu2+变为Cu+，即Cu2O，Cu2O
为砖红色沉淀。

葡萄糖被氧化为糖酸，麦芽糖亦如此。

所以试管甲中有砖红色沉淀。

12、结果表明，肝糖原被成功提取出来，且含量较多。

肝糖原的提取和鉴定
[目的要求]
了解并掌握糖原测定的实验原理及实验方法。

[实验原理]
肝脏和肌肉组织中糖原的含量最高，适于作糖原的提取鉴定。

糖原在浓碱溶液中稳定，肝组织先置浓碱中加热，使蛋白质及其他成分分解而保留肝
糖原。

浓H
2SO
4
使糖原脱水生成糠醛衍生物，后者再和蒽酮作用形成蓝色化合物，与同法处
理的标准葡萄糖溶液比色定量。

[试剂]
1．0.9% NaCl。

2．30% KOH。

3．标准葡萄糖液（0.05mg/ml）。

4．显色剂：于浓H
2SO
4
（比重1.84）100ml中加入蒽酮0.2g。

此试剂不稳定，以当
日配用为宜。

冰箱保存可用4～5天。

[器材]
1．100ml容量瓶；
2．721分光光度计；
3．水浴箱。

[操作步骤]
1．迅速处死小鼠，立即取出肝脏，用0.9%NaCl溶液洗去附着的血液并用滤纸吸干，准确称取肝组织0.5g，放入盛有30% KOH溶液1.5ml的试管中，置沸水浴中煮20分钟，取出后冷却，将管内容物全部移入50ml容量瓶中（用水多次洗涤试管，一并收入容量瓶），加水至刻度，仔细混匀。

摇匀，置沸水浴中10分钟，冷却，以空白管调节零点，用620nm波长比色。

3．计算：
测定管吸光度/标准管吸光度×100μg×1/1.11×100/0.5×100×10-6＝g糖原/100g 肝组织。

注：1.11是此法测得葡萄糖含量换算为糖原含量的常数，即100μg糖原用蒽酮试剂显色相当于111μg葡萄糖用蒽酮试剂所显的色。

[注意事项]
1．肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。

2．注意定量转移，吸取量务必准确。

3．蒽酮试剂必须两倍与被测液。

4．此法试剂纯、操作简便、迅速。

但肝糖原含量宜在1.5～9%之间。

肝糖原的提取和鉴定
原理
肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一。

储存量虽不
多，但在代谢过程中，它是维持血糖平衡及体内糖的重要
来源之一。

其合成或分解，对血糖浓度的调节起着重要的
作用。

糖原是一高分子化合物（分子量约为400万）。

微溶于
水，无还原性，与碘作用生成红色。

提取糖原时，将新鲜
的肝组织与石英砂及三氯醋酸共同研磨。

这样当肝组织被
充分破碎后，其中的蛋白质会被三氯醋酸所沉淀。

而糖原
仍留于溶液中。

当过滤除去沉淀后，滤液中的肝糖原可通
过加入乙醇而沉淀下来。

将沉淀的糖原溶于水，一部分做
碘的颜色反应，一部分经酸水解成葡萄糖后，用斑氏
（Benedict）试剂检验。

试剂及器材
♉ 1. 10％(w/v)三氯醋酸溶液：
♉ 2. 5％(w/v)三氯醋酸溶液：
♉ 3. 95％(v/v)乙醇：
♉ 4. 浓盐酸（HCL比重1.19）
♉ 5. 20％(w/v)NaOH溶液：
♉ 6. 碘液：
♉ 7.斑氏试剂：
♉ 8.剪刀、镊子、研钵、石英砂
♉ 9．水浴锅、刻度吸管
♉ 10. 滤纸、PH试纸（1-14）
操作
1、肝糖原的提取
(1) 打昏实验大白鼠，放血至死。

立即取出肝脏，迅速用滤纸吸去附着
的血液。

(2)称取肝组织约1ｇ，置乳钵中。

加入洗净的石英砂少许及10％三氯醋
酸1ml，然后研磨。

(3)再加5％三氯醋酸2ml，继续研磨，至肝脏组织已充分磨成肉糜状为
止。

然后以2500rpm离心10min。

(4)将上清液转入另一离心管，测量其体积。

(5)加入等体积的95％乙醇。

混匀后，静置10min，此时可见糖原呈絮状
析出。

(6)将此混合物以2500rpm离心10min。

弃去上清液，并将离心管倒置于
滤纸上1－2min。

(7)向沉淀内加入蒸馏水1ml，再用玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即得糖原溶液。

2.鉴定
(1)糖原的颜色反应
取小试管2支，按下表编号操作：
(2)糖原的酸水解实验
1）将剩余的糖原溶液转入一支试管内，加入浓
盐酸3滴后，将之放在沸水浴中加热10min。

取出
冷却，然后以20％NaOH溶液中和至中性（用pH
试纸检验）。

2）在上述溶液内，加入斑氏试剂2ml。

再将该
试管置沸水浴加热5min，取出冷却。

观察沉淀的
生成，并解释之。

思考题
1、在肝糖元的提取过程中，应注意什么？
2、糖元酸水解后会生成什么物质? 用斑氏试剂检验后会产生什么现象?。