冻干前后红细胞血型及生物活性指标的检测

冻干前后红细胞血型及生物活性指标的检测
吴学忠;刘忠;吕蓉;李敏;李素萍;於娟;赵丹
【摘要】目的检测冻干前、后红细胞血型抗原及其生物学活性,了解冻干前、后红细胞血型抗原及其生物学活性的变化情况.方法红细胞血型抗原的检测采用血型血
清学方法,2,3-DPG和ATP用ELISA法.结果在ABO、Rh、MNSs、Kell、Duffy、P血型抗原中,冷冻前、冻干后红细胞血型抗原一致;在Lewis血型抗原中,冷冻前、冻干后红细胞血型抗原有变化.冷冻前、冻干后红细胞2,3-DPG和ATP含量均无
明显变化.结论冷冻前、冻干后红细胞Lewis血型系统中的Lea和Leb血型抗原变化有明显差异;冷冻前、冻干后红细胞2,3-DPG和ATP含量变化无统计学意义.%Objective To detect the blood group antigens, the levels of 2,3-DPG and ATP of red blood cells (RBCs) before and after freeze-drying. Also the changes of blood group antigens and biological activity of RBCs before
and after RBCs freeze-drying was observed. Methods The blood group antigens of RBCs were detected by the blood group serology, the levels of 2,3-DPG and ATP were detected by ELISA. Results The blood group antigens of RBCs were the same as before and after freeze-drying about ABO, Rh, MNSs, Kell, Duffy and P blood group systems. But the blood group antigens of RBCs of Lewis blood group systems were different before and after freeze-drying. The levels of 2,3-DPG and ATP of RBCs before and after freeze-drying didn't change significantly. Conclusion The Lea and Leb blood group antigens of RBCs before and after freeze-drying
of Lewis blood group systems have changed significantly. The levels of 2,3-
DPG and ATP of RBCs before and after freeze-drying havn't chenged significantly.
【期刊名称】《临床输血与检验》
【年(卷),期】2011(013)004
【总页数】4页(P316-319)
【关键词】冷冻干燥;红细胞;血型;生物活性
【作者】吴学忠;刘忠;吕蓉;李敏;李素萍;於娟;赵丹
【作者单位】230031 安徽省合肥市中心血站;230031 安徽省合肥市中心血站;230031 安徽省合肥市中心血站;230031 安徽省合肥市中心血站;230031 安徽省合肥市中心血站;230031 安徽省合肥市中心血站;大连医科大学检验医学院【正文语种】中文
【中图分类】R318.52;R331.1+41
真空冷冻干燥保存是一种理想的红细胞保存方法,但该技术尚处于实验探索阶段。

冷冻干燥对于红细胞而言是一个不利的综合影响过程,细胞在此过程中既要受到冷冻的打击又要受到干燥的损伤,并且该过程中红细胞血型抗原以及生物活性是否发生变化,关系到冻干红细胞能否用于临床。

鉴于此,为了解冷冻干燥后红细胞血型抗原及其生物活性的变化情况,笔者进行了冷冻前、冻干后红细胞血型抗原及其生物活性的比较,以便为真空冷冻干燥保存红细胞研究提供基础。

1 实验仪器 -80℃超低温冰箱(MDF-U52V型,日本 SANYO公司)、真空冷冻干燥仪(Wizard 2.0型 ,美国 Virtis公司 )、酶标仪 (Sunrise型 ,瑞士Tecan公司 )。

2 实验材料浓缩红细胞来源于安徽省血液中心/合肥市中心血站。

浓缩红细胞用生
理盐水洗涤 3次,每次 3 000 r/min离心 10 min,弃上清液和白膜层,收集洗涤后红细胞置4℃冰箱保存备用。

40%甘油冻干红细胞回收率达到58.87%[1],洗涤后备用。

2,3-DPG和ATP检测时,冷冻前、后待检测红细胞浓度为4×1011/L。

3 主要试剂红细胞冷冻保护剂和复水液(本研究室自配)、血型检测用抗血清(Biotest,Germany)、2,3-DPG检测试剂盒 (RD公司,USA)、ATP检测试剂盒(RD 公司,USA)。

4 红细胞冷冻干燥和复水红细胞冷冻干燥、复水和洗涤按照文献[1]进行操作,2,3-DPG和 ATP检测时,冷干后待检测红细胞浓度为4×1011/L。

5 红细胞血型抗原检测红细胞 A、B、D、C、c、E、e、 Lea、 Leb、 M、 N、S、 K、 k和 P1血型抗原检测用盐水试管法,红细胞s、Fya和 Fyb血型抗原检测用抗人球蛋白法。

冷冻前、冻干后红细胞 ABO、Rh、Lewis、 MNSs、 Kell、Duffy和 P1血型抗原检测严格按照试剂使用说明书操作,在有效期内使用。

6 红细胞 2,3-DPG检测(ELISA法) 冷冻前、冻干后红细胞 2,3-DPG含量检测严格按照试剂使用说明书进行操作,在有效期内使用。

步骤:(1)使用前将所有试剂充分混匀,勿使液体产生大量泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。

(2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,每个待测样品、标准品和空白孔做复孔。

待测样品用标本稀释液1∶1稀释后加50μ l于反应孔。

(3)加入稀释后的标准品50μl于反应孔、加入待测样品50μ l于反应孔内。

立即加入50μ l生物素标记抗体。

盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育 1 h。

(4)甩去孔内液体,没孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。

重复此操作 3次。

(5)没孔加入
80μ l亲和链霉素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育 30 min。

(6)甩去孔内液体,没孔加满洗涤液,振荡 30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。

重复此操作 3次。

(7)没孔加入底物 A、B各50 μ l,轻轻振荡混匀 ,避光37℃温育 10 min。

(8)取出酶标板,迅速加入50μ l终止液,加入终止液后立即测定结果。

(9)在 450 nm波长处用酶标仪测
定各孔的OD值,以OD值为纵坐标,相应的标准品浓度为横坐标,采用Origin7.5软件绘制曲线,待测样品2,3-DPG含量可根据其 OD值由标准曲线换算出相应浓度。

7 红细胞 ATP检测(ELISA法) 冷冻前、冻干后红细胞 ATP含量检测严格按照试剂使用说明书进行操作,在有效期内使用。

步骤:(1)使用前将所有试剂充分混匀,不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。

(2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,每个待测样品、标准品和空白孔做
复孔。

待测样品用标本稀释液1∶ 1稀释后加50μ l于反应孔内。

(3)加入稀释后
的标准品50μ l于反应孔、加入待测样品50μ l于反应孔内。

立即加入50μ l生物素标记的抗体。

盖上膜板,轻轻振荡混匀,37℃温育 1 h。

(4)甩去孔内液体,没孔加
满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。

重复此操作 3次。

(5)没孔加入
80μ l亲和链霉素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育 30 min。

(6)甩去孔内液体,没孔
加满洗涤液,振荡 30 s,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。

重复此操作 3次。

(7)没孔加入底物 A、B各50 μl,轻轻振荡混匀,避光37℃温育 10 min。

(8)取出酶标板,迅速加入50μ l终止液,加入终止液后应立即测定结果。

(9)在 450 nm波长处用酶标仪测定各孔的OD值,以OD值为纵坐标,相应的标准品浓度为横坐标,采用Origin7.5软件绘制曲线,待测样品 AT P含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

8 统计学处理红细胞血型抗原检测结果采用确切概率法分析。

冷冻前、冻干后红
细胞2,3-DPG和ATP含量用配对t检验,应用 Origin7.5软件进行分析。

1 冷冻前、冻干后红细胞血型抗原检测结果见表1。

在 ABO、 Rh、MNSs、 Kell、Duffy、 P1血型抗原检测结果中,冷冻前、冻干后红细胞血型抗原结果没有变化,冷冻前、冻干后血型一致。

但是,在 Lewis血型抗原检测结果中,12份标本中冷冻前
红细胞Lea阳性 3份,冷冻后有 2份标本红细胞血型抗原检测结果阴性。

经确切概率法分析P＜0.05,即冷冻前、冻干后红细胞 Lea的变化有统计学意义。

12份标本中冷冻前红细胞 Leb阳性 9份,冷冻后有 8份标本红细胞血型抗原检测结果阴性,
经确切概率法分析P＜0.05,即冷冻前、冻干后红细胞Leb的变化有统计学意义。

2 冷冻前、冻干后红细胞 2,3-DPG检测结果见表2,冷冻前平均含量为 6.60 mmol/L(RBC数1×107),冻干后平均含量为 13.12 mmol/L(RBC数1×107),t=-1.14
3 2(P=0.296 5),即冷冻前、冻干后红细胞 2,3-DPG含量变化无统计学意义。

3 冷冻前、冻干后红细胞AT P检测结果见表3。

冷冻前、冻干后平均含量分别为23.89μ mol/L(RBC数1× 107)和28.66μ mol/L(RBC数1× 107),t=-0.449
3(P=0.669 0),即冷冻前、冻干后红细胞ATP含量变化无统计学意义。

20世纪 90年代,研究人员开始进行具有真正临床意义的红细胞冻干研究。

甘油是细胞内冷冻保护剂,分子量小,易于透过细胞膜进入红细胞内,甘油作为冷冻保护剂已广泛应用于红细胞的低温保存。

本研究采用 40%甘油含量保护剂和慢速冷冻后进行真空冷冻干燥以及复水后洗涤,检测冷冻前和冻干复水洗涤后红细胞 ABO、Rh、MNSs、Kell、Duffy、P和Lewis等系统中的血型抗原。

在 ABO、Rh、MNSs、Kell、Duffy、 P1系统的血型抗原检测中,结果发现,冷冻前、冻干后红细胞血型抗原结果没有变化,冷冻前、冻干后血型一致。

但是,在本研究的 Lewis系统的血型抗原(Lea和 Leb)检测中,冷冻前、冻干后红细胞血型抗原结果发生变化,冷冻前、冻干后血型不完全一致。

冷冻前、冻干后红细胞Lewis系统中的 Lea和 Leb血型抗原变化差异均有统计学意义(P＜0.05)。

Lewis系统的血型抗原(Lea和 Leb)检测结果发生变化的可能机制为:Lewis血型系统主要有 Lea和 Leb两个主要抗原,当岩藻糖连接在 1型前体和 1型 H的N-乙酰基葡萄糖分子上时,分别形成 Lea和 Leb抗原[2]。

Lea和Leb不是由红细胞合成的,而是从血浆中获得的,它们被当作血型抗原是因为首先从红细胞上被发现的,且这两种抗原不是由一对等位基因决定。

Lewis基因(FUT3)编码一种糖基转移酶,催化一个岩藻糖基到分泌液的 H物质上,产生 Leb抗原,若属非分泌型,分泌液中无 H抗原出现,则催化一个岩藻糖基到H前体物质上,产生 Lea抗原。

因
此,当这些结构被从血浆吸收到红细胞膜上时,多数 H分泌型红细胞是Lea-b+,而那些 H非分泌性红细胞多数是Lea+b-[3]。

冷冻干燥对于红细胞而言是一个不利的综合影响过程,红细胞在此过程中既要受到冷冻的打击,又要受到干燥的损伤,从而引起红细胞从血浆中获得的血型抗原发生脱落,冷冻前、冻干后红细胞血型抗原结果发生变化,冷冻前、冻干后血型不一致。

AT P主要用于维持细胞膜“钠泵”的正常功能,保持红细胞的离子平衡,维持红细胞膜的正常结构和功能。

ATP是评价红细胞活力的重要指标,对维持红细胞膜的完整性、携氧放氧功能和体内存活率均起到重要作用[4]。

红细胞内 AT P含量与红细胞膜的完整性和变形能力密切相关[5]。

2,3-DPG是红细胞在组织中释放氧能力的重要指标,是红细胞能量代谢过程中的中间代谢产物,只要有红细胞的能量代谢,就有2,3-DPG产生。

红细胞保存的研究证明,2,3-DPG的含量在红细胞输注人体后进行正常代谢时可逐步得到恢复[6]。

本研究对40%甘油慢速冷冻干燥红细胞和冷冻前红细胞同时进行了 2,3-DPG和 AT P含量的检测,结果发现,冷冻前、冻干后红细胞2,3-DPG和 ATP的含量变化差异无统计学意义。

本研究与Sowemimo-Coker等[7]研究结果相似,即冻干保存红细胞的 ATP和 2,3-DPG含量与对照组结果相近。

本研究室仍需进一步研究其对红细胞的干燥脱水保护机制以及复水过程中红细胞的损伤防护机制,逐步建立一套有效和操作简便的红细胞冻干保存方法,为进一步的红细胞冻干保存研究提供依据。

【相关文献】
1 吴学忠,刘忠,吕蓉 ,等.甘油含量对冷冻干燥保存红细胞的作用 [J].临床输血与检
验,2010,12(3):227-230.
2 Nishihara S,Narimatsu H,Iwasaki H.Molecular genetic analysis of the human Lewis histo-blood group system[J].J Biol Chem,1994,269,11(46):29271-29278.
3 杰夫.丹尼尔 ,主编.朱自严 ,主译.人类血型 [M].北京:科学出版社,2007:8-10.
4 车辑,刘景汉,欧阳锡林,等.去除血型抗体制备O型红细胞的研究 [J].中国输血杂
志,2008,21(3):186-189.
5 Pittiglio DH.Modern blood banking and transfusion practices[M].Philadelphia:Davis FA Company,1983:3-9.
6 陈燕,陆志刚 ,韩颖.海藻糖负载红细胞及其冻干保存研究[J].中国实验血液学杂志,2006,14(3):605-609.
7 Sowemimo-Coker SO,Goodrich RP,Zerez CR,et al.Refrigerated storage of lyophilized human red cells[J].Transfusion,1993,33(3):322.。