火龙果基因组DNA提取的新方法

火龙果基因组DNA提取的新方法
朱英;陶刚;刘作易;韦茜;金吉芬;刘涛
【摘要】火龙果具有不同于一般植物的组织营养成分特点,它除了含有植物中常见的粗蛋白、糖类、微量元素等外,还含有丰富的维生素和水溶性膳食纤维及一般植物少有的花青素和植物白蛋白等.这些因素使从火龙果植株细胞中提取基目组DNA 的方法与普通植物有很大差异,按照常规方法无法得到理想的实验结果.本文就在提取过程中遇到的问题,如无法有效的抽提分层、去除蛋白质或酚残留等提出了相应的解决办法.
【期刊名称】《种子》
【年(卷),期】2008(027)011
【总页数】2页(P111-112)
【关键词】火龙果;基因组DNA;提取方法
【作者】朱英;陶刚;刘作易;韦茜;金吉芬;刘涛
【作者单位】贵州省农业生物技术重点实验室,贵阳,550006;贵州省生物技术研究所,贵阳,550006;贵州省农业生物技术重点实验室,贵阳,550006;贵州省植物保护研究所,贵阳,550006;贵州省农业生物技术重点实验室,贵阳,550006;贵州省农业科学院,贵阳,550006;贵州省柑橘科学研究所,贵州,罗甸,550100;贵州省柑橘科学研究所,贵州,罗甸,550100;贵州省柑橘科学研究所,贵州,罗甸,550100
【正文语种】中文
【中图分类】S667
火龙果，又称红龙果、仙蜜果等，为仙人掌科量天尺属(Hylocereus undutus)和
蛇鞭柱属(Seleniereus Meja-lantous)的果用栽培品种［1～4］。

火龙果是一种新兴的热带、亚热带果树，它集水果、花卉、蔬菜、保健、医药为一体，具有很高的经济价值［5］。

现在在研究方面还主要集中在栽培技术和成分分析上，由于火龙果细胞组织的营养成分不同于一般植物的特点，它里面除了含有植物中常见的粗蛋白、糖类、微量元素等外，还含有丰富的维生素和水溶性膳食纤维(此类纤维吸水
后其体积会加大膨胀，并产生凝胶状物质)及一般植物少有的花青素、植物白蛋白(一种具有黏性、胶质性的物质)等，因此造成了从火龙果营养细胞中提取基因组DNA的方法与普通植物有很大差异。

通过实验，总结了一种适用于火龙果基因组DNA提取的新方法，并就在提取过程中出现的主要问题进行了分析和讨论。

火龙果植株的幼嫩茎(贵州省柑桔研究所提供)。

离心机(德国Eppendorf)、紫外分光光度计(DU-800，Beckman公司)、凝胶成像系统(英国基因公司)、水平电泳仪(安发玛西亚公司)、恒温水浴锅等。

基因组 DNA提取参照陶刚等［6］对水稻、玉米DNA提取方法并进行改进:取
0.5～0.8 g新鲜茎，在液氮中研磨成粉末状，移至2.0 ml离心管中，加600 μl裂解液(0.5 M NaCl、0.1 M Tris-HCl、0.05 M EDTA、1.5%SDS)，充分混匀，65℃保温1 h，其间混匀几次;加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，抽提 5 min，
12 000 r/min离心20 min，取上清至另一管中，加入0.1倍体积的KAc(5 M)混匀，再加入0.8倍体积的异丙醇混匀，于－20℃静置30 min;吸出DNA至1.5 ml 离心管中，用70%乙醇洗涤2次，吹干后将其溶于500 μl TE;加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，抽提5 min，12 000 r/min离心20 min，取上清至另
一管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，抽提5 min，12 000 r/min离心15 min，取上清至另一管中，加入0.1倍体积的KAc(5 mol/L)混匀，再加入0.8倍
体积的异丙醇混匀，于－20℃静置30 min，吸出DNA至1.5 ml离心管中，用
70%乙醇洗涤2次，风干后将DNA溶于300 μl TE溶液，于4℃保存备用。

取少量上述DNA溶液，在紫外分光光度计下测定波长260 nm、280 nm的光吸
收值。

取少量DNA点样于0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色，按
3.2 材料在选取时应尽量选择较幼嫩部分，加液氮研磨时动作要快，并不断的补充液氮，防止材料变粘，影
3.1 火龙果是一种热带、亚热带植物，成分中含有丰富的水溶性膳食纤维和一般植物很少见的植物白蛋白等，而且本身因渗透压极低而具有独特的黏液，所以在抽提分层中无法得到理想的效果，分层界面不清，无法有效地吸取含有DNA的上清液。

所以我们改变提取策略，先排除影响提取过程中的主要因素，再逐步把基因组DNA从细胞组织液中纯化分离出来。

我们在细胞裂解后先不进行酚和氯仿的抽提，而是直接进行DNA沉淀，然后再按一般的进行提取纯化。

每cm凝胶5 V的恒定电压进行电泳，电泳约1 h，在凝胶成像系统下观察记录。

检测结果表明:用此方法提取的火龙果材料基因组DNA的260 nm、280 nm的光吸收值的比值均在2.0左右(表1)，样品中的蛋白质、糖类和有机试剂等去除较理想。

通过琼脂糖凝胶电泳图谱显示(图1)，火龙果材料提取的基因组DNA均呈现
一条清晰整齐的主带，分子量大小在20～23 kb之间，有少量的RNA残留，基本无降解现象。

由于火龙果植株材料的细胞营养成分组成与普通植物有明显差别，比如含有一般植物少有的花青素、植物白蛋白等，所以它在提取基因组DNA过程中与一般植物有很大不同，按照常规方法提取无法得到理想的基因组DNA。

除了上述主要影响因素外还有很多其它因素，如材料破碎和裂解、操作技术等方面都会对DNA的提取结果产生影响，下面就在提取过程中遇到的问题进行分析讨论。

响裂解效果。

还应尽可能的将材料磨细，便于裂解。

材料在加入裂解液裂解的过程中，应间隔几分钟混匀1次，这样可以使材料与裂解液充分接触;在加酚、氯仿抽提的过程中，应轻
柔地摇动，增加材料与有机溶剂接触面，减少DNA片段的机械断裂，还可以适当延长抽提的时间，最终提高抽提效果。

3.3 在沉淀DNA时，加入KAc后应混匀放置3～5 min，再加入预冷的异丙醇，
这样能够使K+与DNA充分结合形成盐，此盐在异丙醇中不会被溶解或变性［7］。

加入溶液时都应沿管壁轻轻的加入，减少机械剪切，保证基因组DNA的完整性。

3.4 本实验的目的是将提取的基因组DNA进行RAPD实验分析，而DNA中的RNA对RAPD实验的影响不大［8］，所以，少量的RNA存在对实验的结果不会造成影响。

因此，在实验当中没有消化去除RNA。

【相关文献】
［1］许伟东，廖剑锹，刘加健，等.火龙果引种初报［J］.中国南方果树，2002，31(1):33 －34. ［2］张秋芳，张美寿.火龙果的特点与引种技术［J］.福建果树，1999(4):45.
［3］李德勇.栽培火龙果市场前景广阔［J］.农业科技通讯，2001(8):38.
［4］江志鹏.火龙果栽培技术［J］.柑桔与亚热带果树信息，1999，15(2):9.
［5］李兴华.21世纪保健食品——火龙果［J］.云南农业，2001(7):14.
［6］陶刚，刘作易，朱英，等.水稻玉米基因组DNA提取方法的改进［J］.贵州农业科学，2004，2(6):21 －22.
［7］李道明，赵玉琪.实用分子生物学方法手册［M］.北京:科学出版社，1998:176 －178.
［8］方宣钧，吴为人，唐纪良.作物 DNA标记辅助育种［M］.北京:科学出版社，2001:17－25.。