引物探针浓度测定SOP

引物探针浓度测定SOP
引物探针稀释标准操作规程
稀释
1. 取出待稀释的引物探针，12000转/分钟离心5分钟；
2. 使用TE缓冲液稀释至适当浓度，上下颠倒后涡旋震荡1~2分钟；
3. 取2μL引物探针原液，使用TE缓冲液稀释N倍作为待测溶液，涡旋震荡混匀。

NanoDrop One清洁
开始使用NanoDrop One仪器进行检测之前需清洁上下基座：
1. 抬起仪器检测臂，将3-5μL ddH2O移取至下基座；
2. 降下检测臂并等待2-3分钟；
3. 抬起检测臂，用新的滤纸擦拭上下基座。

检测
1. 在“主页”屏幕上，选择核酸选项卡并点击单链DNA；
2. 点击单链DNA设置，确认“基线矫正”处于关闭状态；
3. 将1-2μL TE缓冲液移取到下基座，然后降下检测臂；
4. 点击空白检测并等待检测完成；
※如果自动空白检测设为“开启”，空白检测将会在您降下检测臂时自动开始。

5. 抬起检测臂，用新的滤纸擦拭上下基座；
6. 将1-2μL待测溶液移取到下基座，然后降下检测臂。

7. 点击检测并等待检测完成。

※如果自动检测设为“开启”，检测将会在您降下检测臂时自动开始。

8. 完成检测后，点击结束实验。

9. 抬起检测臂，用新的滤纸擦拭上下基座。

浓度计算
1. 每条引物探针重复检测4次，去除离群值后计算A260平均值，
回算原液浓度（μmol/L）：Co.实测=?X A260÷ε?1000?N。

※ε：Life合成单上Millimolar ExtinctionCoeff.(OD/μmol)，N 为稀释倍数。

2. 按照如下公式计算添加TE缓冲液的量：V添加=（Co.实测/100－1）?V。

12. 取2 μL定量过的引物探针，将其稀释N倍，复测回算浓度应在90~110 μmol/L之间。

注意事项
1. NanoDrop One操作说明书中中提到：对于微体积检测，260nm处（核酸）或280nm处（蛋白质）的最大吸光度应小于6
2.5A。

2. TE缓冲液配方：5mL 1M Tris-HCl，pH 8.0；1mL 0.5M EDTA，pH 8.0；ddH2O定容至500mL。

3. 建议引物探针干粉长期保存请置于-20℃。

4. 建议引物探针溶液分装后-20℃保存。

5. 探针测试的A260保持在0.2~0.8之间精密度最好。