黄芪多糖减轻慢性镉暴露诱导的大鼠肝脏损伤

黄芪多糖减轻慢性镉暴露诱导的大鼠肝脏损伤
安方玉;颜春鲁;刘永琦;伍志伟;苏韫;牛彦强;柳鹏瑶
【摘要】Objective To explore the effects of Astragalus polysaccharides on liver injury induced by cadmium chloride. Methods The cadmium chloride solution was administrated i.v. to develope rat model of liver injury. Rats were randomized divided into three groups;control group, model group, Astragalus polysaccharides intervention group. After the 5 weeks, the rats were sacrificed and the livers were weighted, alanine aminotrans
ferase(ALT), aspartate aminotransferase (AST) and lactate dehydrogenase(LDH), the contents of cadmium(Cd) was checked by plasma mass spectrometerthe(ICP-MS), the contents of interleukin-2(IL-2) and transforming growth factor-β1(TGF-β1) was measured by ELISA, the the protein expression of Bcl-2 and Bax was observed by immunohisto-chemistry staining method. Results The liver weight was increased in model group, the level of ALT, AST and LDH were also ascended in model group, the contents of Cd, TGF-β1 and the protein expression of Bax all increased in mode group(P＜0.05 or P＜0.01). The content of IL-2 and the protein expression of Bcl-2 were decreased in mode group (P＜0.05 or P＜0.01). Compared with the model group, the liver index was decreased in Astragalus polysaccharides intervention group, the levels of ALT, AST and LDH were also reduced in Astragalus poly-saccharides intervention group, the contents of Cd, TGF-β1 and the protein expression of Bax were all dropped in Astragalus polysaccharides intervention group(P＜0.05 or P＜
0.01).The content of IL-2 and the protein expression of Bcl-2 increased in Astragalus polysaccharides intervention group(P＜0.05 or P＜0.01). Conclusions Astragalus polysaccharides may reduce the oxidative stress injury of rats liver cells indued by cadmium chloride, and its mechanism may be explained by regulation of Bcl- 2/Bax protein expression.%目的研
究黄芪多糖对慢性镉暴露诱导大鼠肝脏损伤的影响.方法将大鼠随机均分为对照组、模型组和黄芪多糖干预组(用腹腔注射氯化镉复制大鼠肝脏损伤模型),5周后处死
大鼠取出肝脏.称重法计算大鼠肝指数;比色分析法检测大鼠血清和肝脏谷丙转氨酶(ALT)活性、谷草转氨酶(AST)活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性;用电感耦合等离子质
谱仪检测肝脏镉(Cd)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠肝脏白细胞介素-
2(IL-2)和转化生长因子β1(TGF-β1)的含量;免疫组化法观察大鼠肝脏Bcl-2和
Bax的蛋白表达.结果与对照组比较,模型组大鼠肝指数、ALT活性、AST活性、LDH活性、Cd含量、TGF-β1含量和Bax蛋白表达均升高(P＜0.05或P＜0.01);
但模型组大鼠IL-2含量和Bcl-2蛋白表达下降(P＜0.0l).与模型组比较,黄芪多糖能显著降低模型组大鼠肝指数、ALT活性、AST活性、LDH活性、Cd含量、TGF-
βl含量和Bax蛋白表达(P＜0.05或P＜0.01);但黄芪多糖能显著提高模型组大鼠
IL-2含量和Bcl-2蛋白表达(P＜0.0l).结论黄芪多糖可能是通过调控Bcl-2/Bax蛋白表达来减轻镉致大鼠肝细胞氧化应激损伤.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2018(038)002
【总页数】5页(P189-193)
【关键词】黄芪多糖;镉;肝损伤
【作者】安方玉;颜春鲁;刘永琦;伍志伟;苏韫;牛彦强;柳鹏瑶
【作者单位】甘肃中医药大学教学实验实训中心,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学教学实验实训中心,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学基础医学院,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学基础医学院,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学基础医学院,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学临床医学院,甘肃兰州 730000;甘肃中医药大学中医临床学院,甘肃兰州 730000【正文语种】中文
【中图分类】R135.99
镉(cadmium，Cd)是一种毒性大、蓄积性强的重金属毒物[1]。

当摄入量逐渐增加时，可引起机体多脏器产生不同程度的损害作用[2]。

长期低剂量的镉摄暴露可造成肝脏不同程度的氧化应激损伤，会引起肝发生炎性反应、水肿和出血等病理改变[3]。

黄芪具有保肝、利尿、抗衰老和抗应激等药理作用[4]。

但对其慢性镉中毒大鼠肝脏损伤的保护作用尚不明确。

本研究以大鼠慢性镉中毒模型为对象，观察黄芪多糖对氯化镉所致大鼠肝脏损伤的保护作用。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：SPF级Wistar大鼠36只，体质量(180±20)g，雌雄各半[甘肃中医药大学科研实验中心提供，实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011- 0001- 0001344]。

1.1.2 试剂：氯化镉(天津市巴斯夫化工有限公司)；羧甲基纤维素钠 (天津市大茂化学试剂厂)；考马斯亮兰试剂盒和AST、ALT及LDH检测试剂盒(南京建成生物工
程研究所)；Rat IL- 2 precocated ELISA kit 和Rat TGF-β precocated ELISA kit 检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)；Bax和Bcl- 2抗体(ImmunoWay Biotechnology公司)；药材选用甘肃地道药材黄芪，由甘肃中医药大学科研实验
中心药物制剂实验室提取、分离、鉴定(纯度达到50%以上)。

1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理：将大鼠随机分为3组：对照组、模型组(腹腔注射0.1%氯
化镉，1.5 mg/kg相当于1.5 mL/kg，5次/周，共5周)、黄芪多糖干预组(给予
黄芪多糖20 mg/kg灌胃治疗，1次/d，连续5周)，每组12只。

末次给药后，
取肝脏备用。

1.2.2 大鼠肝指数测定的结果：末次给药24 h后，称量大鼠体质量，股动脉采血
处死大鼠。

摘取大鼠的肝脏称重并计算肝指数。

肝指数=肝脏质量(mg)/体质量(g)。

1.2.3 大鼠肝组织细胞因子测定结果：按照ELISA试剂盒说明书测定大鼠肝组织白细胞介素- 2(IL- 2)及转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量。

肝匀浆液的制备采用
1:10比例。

1.2.4 大鼠肝组织酶活性和Cd含量测定结果：均严格按照试剂盒说明测定肝组织
谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，镉(Cd)含量。

肝匀浆液制备同1.2.3。

1.2.5 大鼠肝组织Bcl- 2和Bax蛋白表达的测定：采用SP法，加入Bax和Bcl- 2抗体(1∶300，1∶400)，4 ℃孵育过夜。

次日，加入相应生物素标记的二抗
(1∶100)孵育，最后经DAB 显色、质染。

以染色呈棕黄色或棕褐色颗粒表达为阳
性结果。

400倍镜下每张切片随机选取5个视野，每视野选5个阳性区域进行平
均吸光度值测量，表达强弱与吸光度值呈反比。

1.2.6 大鼠血清酶活性测定结果：按照试剂盒说明书测定血清谷草转氨酶(AST)活性、谷丙转氨酶(ALT)活性和乳酸脱氢酶(LDH)活性。

血清的制备采用股动脉采血和静置，离心的方法获得。

1.3 统计学分析
采用SPSS 17.0统计软件分析，将实验数据所得结果用均数±标准差表示，采用单因素方差分析(One-Way-Anova)。

2 结果
2.1 大鼠肝指数的测定结果
与对照组比较，模型组大鼠肝脏指数显著升高(P<0.05)。

与模型组比较，黄芪多糖干预组大鼠肝脏指数明显回降(P<0.05)(表1)。

表1 各组动物肝脏指数结果比较Table 1 Comparison of liver indexes in each group rats groupsLiverindex/(mg/g)control 2.62±0.32model
3.59±0.76#Astragaluspolysaccharidesintervention 3.03±0.35*
#P<0.05 compared with control；*P<0.05 compared with model.
2.2 大鼠肝组织细胞因子含量测定结果
与对照组比较，模型组大鼠肝组织IL- 2含量显著降低，TGF-β1含量显著升高(P<0.01)；与模型比较，黄芪多糖干预组大鼠肝组织IL- 2含量回升，TGF-β1含量显著回降(P<0.01)(表2)。

表2 各组动物肝组织IL- 2和TGF-β1含量比较Table 2 Content comparison of IL- 2 and TGF-β1 in liver tissue of each group rats(±s，n=12)groupsIL-
2/(pg/mL)TGF-β1/(pg/mL)control 140.71±14.25
3.91±0.43model97.38±16.15#
7.32±0.54#Astragaluspolysaccharidesintervention 134.04±13.61*
5.15±0.63*
#P<0.01 compared with control；*P<0.01 compared with model.
2.3 大鼠肝组织酶活性和Cd含量测定结果
与对照组比较，模型组大鼠肝组织AST、ALT与LDH活性和Cd含量均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖干预组大鼠肝组织AST、ALT与LDH活性和Cd含量均显著回降(P<0.01)(表3)。

表3 各组动物肝组织AST、ALT及LDH的活性和Cd含量比较Table 3 Content comparison of AST,ALT,LDH and Cd in liver tissue of each group rats groupsAST(U/gprot)ALT(U/gprot)LDH(U/gprot)Cd/(mg/kg)control 154±14 144±7 605±160model234±11# 242±6#
762±24#32.62±1.69#Astragaluspolysaccharidesintervention 178±14* 184±5* 642±29* 23.19±1.85*
#P<0.01 compared with control；*P<0.01 compared with model.
2.4 大鼠肝组织Bcl- 2活性和Bax蛋白表达结果
Bcl- 2和Bax在正常机体的表达主要在肝细胞的胞质中表达。

与对照组比较，镉染毒模型组大鼠肝组织中Bcl- 2表达下降，Bax表达升高(P<0.05)。

与模型组比较，黄芪多糖干预组大鼠肝组织Bcl- 2表达回升，Bax表达回落(P<0.05)(表4,图1)。

表4 各组动物肝组织Bcl- 2和Bax蛋白表达吸光度值比较Table 4 Absorbance values comparison of protein expres- sion of Bcl- 2 and Bax in liver tissue of each groupsBcl-2Baxcontrol99±13 157±21model 145±19#
112±18#Astragaluspolysaccharidesintervention 106±10** 145±20*
*P<0.05，**P<0.01 compared with model；#P<0.01 compared with control.
2.5 大鼠血清酶活性测定结果
与对照组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、LDH活性均显著升高(P<0.05)；与
模型组比较，黄芪多糖干预组大鼠血清AST、ALT、LDH活性均显著回降
(P<0.05)(表5)。

A.control;
B.model;
C.astragalus polysaccharides intervention图1 各组大鼠
肝组织Bcl- 2和Bax蛋白表达Fig 1 Protein expressin of Bcl- 2 and Bax in liver tissue of each group rats(IHC-P，×400)表5 各组动物血清AST、ALT和LDH活性比较Table 5 Activity comparison of AST、ALT and LDH in serum
of each group rats
gr oupASTALTLDHcontrol120±1832.71±5.43930±79model162±20#75.33±7 .28#1537±84#Astragaluspolysaccharidesintervention131±16**
44.02±6.81** 1281±114*
*P<0.05，**P<0.01 compared with model；#P<0.01 compared with control.
3 讨论
镉摄入过量可在机体包括肝等多种组织器官中沉积。

其毒性作用可能是蓄积在肝中的镉一方面使肝细胞膜发生脂质过氧化反应，诱导机体产生大量自由基，进一步加重膜结构的破坏，从而加重镉对肝组织的损害[5]；另一方面镉会使肝细胞通透性
发生改变，肝组织AST和ALT可随染镉剂量的增加和时间的延长急剧升高，因此，肝脏AST和ALT活性增强是反映肝损伤最敏感的指标[6]；最后，大量镉摄入机体会导致机体发生代谢紊乱，导致某些酶活性发生改变。

此外，细胞因子在镉毒中主要参与免疫调节和炎性反应。

其中，IL- 2通过和IL- 2R作用，参与调节机体的细胞免疫、体液免疫和NK细胞的杀伤活性[7]。

TGF-β1 主要参与调节免疫、诱导细胞分化、促进ECM形成等多种生理功能[8]。

近年来，Bcl- 2家族在镉毒中的作用也逐渐被关注，Bcl- 2和Bax是一对调控细胞凋亡的关键基因[9]。

Bcl- 2为抑制细胞凋亡的基因，而Bax是一个能够促进细胞凋亡的基因[10]。

因此，Bcl- 2的表达升高和Bax的表达降低，有利于细胞的存活。

有研究发现，急慢性镉暴露可影响细胞增殖、诱导细胞凋亡[11- 12]。

本实验表明，大鼠腹腔注射氯化镉后，其肝及血清中ALT、AST及LDH活性均增强，并且肝组织Cd含量、TGF-β1含量和Bax的蛋白表达均升高，而肝组织IL- 2含量和Bcl- 2的蛋白表达均降低，说明镉可以引发大鼠肝的氧化应激损伤、免疫功能受损或可能发生纤维化；而黄芪多糖干预组可明显降低肝及血清中上述酶的活性、可明显升高肝组织IL- 2含量和Bcl- 2的蛋白表达，降低肝组织TGF-β1含量和Bax的蛋白表达，提示其对肝脏的保护作用是通过调节酶活性、免疫功能和Bcl- 2/Bax的蛋白表达来完成的。

总之，黄芪对镉染毒大鼠肝损伤具有保护作用，其机制可能是通过调节Bcl-
2/Bax的蛋白表达，间接实现对肝组织细胞因子及酶活性的调控作用，从而减缓镉在肝组织的沉积，进而促进镉在机体的重新分布，但黄芪对镉中毒的干预机制尚需进一步深入探究。

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