茶子未成熟胚子叶柄离体培养诱导再生植株

茶子未成熟胚子叶柄离体培养诱导再生植株
黄燕芬;周国兰;赵华富
【摘要】Results from in vitro culture and plant regeneration of cotyledon petiole of immature embryo from Camellia sinensis, aiming at increasing the individual number of hybrid Camellia sinensis rapidly,show that the imature embryo can normally germinate on the two media, MS+BA 3
mg/L+IBA 2 mg/L+ YE 200 mg/L and improve ER+BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L; Callus can be induced and regenerated on medium of improve
ER+BA 2. 5 mg/L+NAA 0. 2 mg/L. The propagation effect of callus with bud (propagation time 5.4, suitable culture period 39 d) is significantly better than stem segment with axillary bud, the effective seedling rate is up to 83％ with strong and tidy shoots. The optimum medium for radication is 1/2 improved ER+IBA 0.1 mg/L.%为迅速提高茶树杂交后代群体的个体数,进行了茶树未成熟胚培养获得芽苗及子叶柄,再以芽苗和子叶柄为外植体诱导再生植株的试验.结果表明:MS+BA 3 mg/L+IBA 2 mg/L+YE 200 mg/L和改良ER+BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L两种培养基均能较好地诱导未成熟胚正常萌发;改良ER+BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基可较好地诱导子叶柄产生愈伤组织并分化出芽;以培养带芽愈伤组织块方式增殖效果明显比用带腋芽茎段增殖方式好:增殖倍数为5.4,继代周期39 d,芽苗健壮整齐,有效苗率达83%;芽苗生根的最适培养基为1/2改良ER+IBA 0.1 mg/L.
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2011(039)003
【总页数】3页(P31-33)
【关键词】茶树;子叶柄;培养;再生植株
【作者】黄燕芬;周国兰;赵华富
【作者单位】贵州师范学院,贵州,贵阳,550018;贵州省茶叶研究所,贵州,湄
潭,564100;贵州省茶叶研究所,贵州,湄潭,564100
【正文语种】中文
【中图分类】S571.1
茶树〔Camellia sinensis(L.)Kuntze〕是异花授粉作物。

长期异花授粉，导致基因性状多样化，难以达到自然选育育种目标所要求的变异方向和预期的选择效果[1]。

因此，人工杂交已成为国内外茶树育种的主要手段。

但在自然生长条件下，茶树的杂交结实率非常低，杂交种子的获得数很少，致使F1代群体过小，加上茶树的生长周期较长，选育出的品种其特性与优势都不明显，育种目标难以真正实现，使得采用人工杂交手段进行茶树育种比较困难，茶树杂交育种工作长期滞后于其他作物。

通过茶树未成熟胚子叶柄离体培养，可加速育种材料的繁殖速度，增加杂种群落个体数，从而扩大杂交后代筛选范围，加强茶树杂交育种的效果，缩短育种年限，这对于茶树杂交育种有着重要而实际的应用价值。

1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为福鼎大白茶树未成熟蒴果，取自贵州省茶叶研究所。

1.2 方法
1.2.1 无菌播种
1) 材料消毒：选取生长健壮，饱满无病虫害的茶树未成熟蒴果，在自来水下冲洗
2 h，用75%的酒精漂洗30 s，无菌水冲洗2次，去掉果壳，取出种子，再用0.1%的升汞溶液消毒15 min，无菌水洗5～6次，沥干水分备用。

2) 诱导未成熟胚萌发：消毒好的种子于超净工作台上去掉种壳，切掉2/3子叶后，分别接种于不同萌发培养基(成分见表1)中培养，探索诱导未成熟胚萌发的培养基
类型和激素配比。

1.2.2 子叶柄诱芽
1) 初代培养：当无菌苗超过1 cm高时，子叶柄已伸长至3 mm以上，将子叶柄
从胚轴上切下，另一端保留少量子叶，按MS培养基诱导的子叶柄对应MS培养基，改良ER培养基诱导的子叶柄对应改良ER培养基，接种于诱芽培养基中培养(成分见表2)，筛选诱导愈伤组织及再生芽苗的适宜培养基配方。

2) 继代培养：将初代培养诱导的丛生芽团分割成的带3个芽的愈伤组织切块，较
高芽苗(包括未成熟胚芽苗)切割成的带1～2个腋芽的茎段分别接种到改良ER+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的增殖培养基中培养，每周观察1次增殖效果，确定
增殖倍数、最适增殖周期。

1.2.3 生根培养增殖的无根芽苗接种于壮苗培养基中培养，待芽苗高至3cm左右
移至生根培养基(成分见表4)中诱导生根，探索适宜生根培养基配方。

1.2.4 培养条件培养基附加蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.6～5.8；培养室温
度(24±2)℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间12 h/d。

2 结果与分析
2.1 不同培养基和激素对未成熟胚萌发的影响
播种于不同培养基中的茶树未成熟胚，萌发时间不同，萌发率不同，萌发出的幼苗生长状况也不尽相同。

从表1可看出，处理1和处理5培养基不含激素，播种的
未成熟胚萌发时间、萌发率、培养50 d幼苗生长状况均处于较差水平，且处理1
未诱发出正常苗；播种的未成熟胚在2种基本培养基上均表现出相同生长素水平条件下，随着细胞分裂素水平的逐渐升高，未成熟胚的萌发先受到激发，后受到抑制的现象，可见未成熟胚的萌发与基本培养基类型关系不大，但需要一定量的激素调控；子叶柄伸长的长度与幼苗长度协调，似乎与培养基类型和激素配比的关系不大。

2.2 不同培养基和激素对子叶柄分化芽苗的影响
子叶柄培养40 d左右，表面出现少量细小绿色芽点。

转入新鲜培养基14 d后，芽点长大成芽，子叶柄表面出现绿色、浅绿色、乳白色等颗粒状、团状愈伤组织，2周后愈伤组织诱导达到高峰，10 d后陆续分化出大量芽[2-3]。

从表2可知，在MS培养基的3个处理及改良ER培养基的3个处理中愈伤组织诱导率均随激素水平的升高而升高，分化芽率也随激素水平的升高而升高，但芽生长情况较理想的只有处理5。

可见，提高激素水平可提高分化芽率，但超过一定量会影响芽正常生长[3]。

就2种基本培养基而言，MS培养基中处理2的综合诱导效果相对较好，改良ER培养基则是处理5较好，二者相比后者明显优于前者。

表1 不同培养基和激素下未成熟胚的萌发情况Table 1 Germination of immature embryo on different medium at different hormone level注：子叶柄长度指幼苗1.5 cm左右长时的长度。

Note: Cotyledon petiole length refer to the length when the seedling is 1.5 cm long.处理Treatment 培养基组合/(mg/L)Medium composition 未成熟胚萌发时间/dGermination time of immaturate embryo未成熟胚萌发率/%Germination rate of immaturate embryo 幼苗生长状况(培养50 d)Seedling growth status子叶柄长度
/mmCotyledon petiole length1MS3030色黄、粗短4.22MS+BA 2+IBA 2+YE 2001369色绿、弱小4.03MS+BA 3+IBA 2+YE 200789色绿、健壮
4.14MS+BA 4+IBA 2+YE 2001683色绿、健壮4.35改良ER2241色浅绿、较细
弱4.36改良ER+BA 2.0+NAA 0.21468色绿、健壮4.17改良ER+BA 2.5+NAA 0.2987色绿、健壮4.38改良ER+BA 3.0+NAA 0.21280色绿、较健壮4.2
表2 不同培养基和激素下子叶柄芽苗的分化情况Table 2 Differentiation of cotyledon petiole shoot on different medium at different hormone level处理Treatment 基本培养基Basic medium激素配比/(mg/L)Hormone proportionBANAAIBAGA3愈伤组织诱导率/%Induction rate of callus分化芽
率/%Differentiation rate芽生长情况Shoot growth status1MS2.513574纤细,高2MS3.024281细,较弱3MS3.535884细密,弱4改良ER2.00.114671细,弱5
改良ER2.50.215782正常,较健壮6改良ER3.00.316787细密,弱
2.3 不同培养时间与增殖方式对芽苗生长的影响
带芽愈伤组织切块及带腋芽茎段，在培养20 d后，开始分化新芽。

从表3可知，带芽愈伤组织切块增殖倍数最高的是培养46 d，然而培养39 d的芽苗生长状况最好，有效苗率最高，且增殖倍数仅次于培养46 d的。

随着培养时间的增加增殖倍数虽然增大，但芽苗分化过多，生长空间拥挤，营养不足，生长状况不好，使有效苗率降低。

因此，较适增殖周期应为39 d。

带腋芽茎段在培养39 d内，随着培养时间的增加，增殖倍数和有效苗率呈上升趋势，但芽苗生长状况欠佳。

到46 d时增殖倍数虽未明显增加，但芽苗健壮，有效苗率增加，故较适增殖周期应为46 d。

2种增殖方式相比，带芽愈伤组织切块增殖无论是增殖周期、增殖倍数，还是芽苗生长状况、有效苗率均具有较大优势。

表3 不同培养时间与增殖方式下芽苗的生长情况Table 3 Propagation and growth of shoot with different culture time and pattern注：*表示芽苗叶片
较小、叶色较浅、矮小；* *表示芽苗叶片大小、叶色深浅、整齐度一般；* * *表
示芽苗细密、叶色较深、整齐度差；* * * *表示芽苗叶片较大、叶色较深、健壮、整齐度好。

Note: *, **, *** and **** indicate little shoot with small and light-
colored blade, shoot with small and light-colored blade and general uniformity, thin and close shoot with brunet blade and bad uniformity, strong shoot with large and brunet blade and good uniformity.培养时间
/dCulture time带芽愈伤组织切块 Callus with bud增殖倍数芽苗生长状况有效苗率/%带腋芽茎段 Stem segment with axillary bud增殖倍数芽苗生长状况有效苗率/%253.2∗321.2∗30324.6∗∗521.8∗∗32395.4∗∗∗∗832.2∗∗∗34466.7∗∗∗692.3∗∗∗∗37
表4 不同培养基下根的诱导情况Table 4 Root induction on different medium 处理Treatment 培养基/(mg/L)Medium 发根率/%Rooting rate平均根长
/cmMean root length平均根数/棵Mean number of root11/2MS+IBA
0.05570.64.421/2MS+IBA 0.10630.95.531/2MS+IBA 0.15601.15.341/2改良ER+IBA 0.05700.96.251/2改良ER+IBA 0.10781.56.561/2改良ER+IBA
0.15771.36.0
2.4 不同培养基对根诱导的影响
由表4可见，处理1～3中，处理2无根苗发根率最高，平均根数最多，平均根长第2。

处理4～6中，处理5无根苗发根率最高，平均根数最多，平均根长最长；处理2和处理5的IBA浓度均为0.1 mg/L，说明，0.1 mg/L的IBA较适宜于无根苗生根[4]；处理5的无根苗发根率、平均根数、平均根长明显优于处理2，且3种IBA浓度的1/2改良ER培养基诱根效果均优于3种相应IBA浓度的1/2 MS 培养基。

可见，1/2改良ER培养基更适合于根的生长。

因此，较适宜于无根芽苗生根的培养基为1/2改良ER+IBA 0.1 mg/L。

3 结论与讨论
试验发现，8月中旬以前采集的未成熟胚过于幼嫩，尚处于发育中(胚直径小，被包围于种皮内富含营养物质的透明胶体中)，较难诱导正常萌发。

在此时间之后采
集的近成熟胚在MS+BA 3 mg/L+IBA 2 mg/L+YE 200 mg/L和改良ER+BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L培养基中均能较好萌发[5]，可能是因为适量的激素能消除后熟期的影响，促进胚的成熟。

子叶柄的长度与幼苗长度协调，似乎与基本培养基类型和激素水平无关。

根据试验所得的增殖倍数和继代周期，8月中旬采摘的1个未成熟胚(以初代诱导出10个芽苗用于增殖计算)经196 d培养可获得296棵再生苗[6]。

1粒采播于10月中旬的茶树种子，经5～6个月才长成相同高度的1株苗。

因此，茶树未成熟胚培养诱导子叶柄，再以子叶柄为外植体诱导再生植株是一种高频率的再生途径，且以子叶柄为外植体，通过无性繁殖方式得到的大量杂交后代遗传特性稳定，杂种优势固定，便于从中筛选优良目标单株。

此方法应用于茶树常规杂交育种可缩短育种年限，加速良种推广。

[参考文献]
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[2] 刘德华，廖利民.茶子子叶柄下胚轴组织培养的研究[J].福建茶叶，1988(2)：13-15.
[3] 王立，杨素娟，王玉书.茶树未成熟胚离体培养植株的形成[J].中国茶叶，1988(4)：16-18.
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[5] 王玉书，杨素娟，成浩，等.茶树未成熟胚组培育苗技术的研究[J].茶叶科学，1990,10(1)：11-18.
[6] 谭文澄，戴策刚.观赏植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社，1998.。