半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)在成年小鼠生殖系统的表达以及雌二醇和孕酮对CSD在子宫中表达的调控

ｂｅｃａｍｅ ａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ａｓ ｔｈａｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏａｓ ｃｙｃｌｅ．Ｔｈｅ ｓｔｒｕｍａｌ ｃｅｌｌｓ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｏｒ ＣＳＤ ｆｒｏｍ Ｄ３ ｔｉｌｌ Ｄ６，
ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅｓｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｂｅｃｏｍｅ ｗｅａｋｌｙ ｓｔｍｎｅｄ ｓｉｎｃｅ Ｄ７ ａｎｄ ａｌｍｏｓｔ ｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄ ｏｎ
１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｖｅ ｆｉｒｓｔｌｙ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＣＳＤ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｂｏｔｈ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｌｓｏ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｕｔｅｒｕｓ，ｏｖｉｄｕｃｔｓ ａｎｄ ｏｖａｒｙ ｈａｖｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ ｔａｕｒｉｎｅ ｖｉａ ｔｈｅ ＣＳＤ ｐａｔｈｗａｙ．Ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣＳＤ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｌｍｏｓｔ ａｌｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｆｅｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｔｅｒｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｕｎｄｉｂｕｌａｒ，ａｍｐｕｌｌａｒ ａｎｄ ｉｓｔｔｕｎｉｃ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｏｖｉｄｕｃｔ．Ｎｏ ｃｙｃｌｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｕｔｅｒｕｓ ｗｈｉｌｅ ｓｏｍｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ ａｒｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｍｎｅｄ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｕｓ ｐｈａｓｅ ｔｈａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｐｈａｓｅｓ．Ｉｎ ｔｈｅ ｏｖａｒｙ，ｓｔｒｏｎｇ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ｆｏｒ ＣＳＤ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｌａｙｅｒ ａｎｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｏ ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ ｓｔａｇｅｓ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｚｏｎａ
２．ＣＳＤ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｕｔｅｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｉ－ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ．
Ｏｎ ｐｒｅｇｎａｎｔ ｄａｙｓ １（Ｄ１）ａｎｄ Ｄ２，ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｆｅｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｍｍｎｕｏｓｔａｉｎｅｄ ｆｏｒ ＣＳＤ，
ⅡＩ
ｕｔｅｒｉｎｅ ＣＳＤ ｌｅｖｅｌ ａｔ ｂｏｔｈ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ．Ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ，Ｅ２ ｉｓ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈａｎ Ｐ４．Ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ４ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ４ ａｎｄ Ｅ２ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ
中文摘要
牛磺酸是哺乳动物生殖系统中含量最丰富的游离氨基酸之一，在生殖系统中起着重要的作 用·但是生殖系统能否合成牛磺酸并没有详尽的报道。半胱亚磺酸脱羧酶（ＣＳＤ）是牛磺酸生物 合成途径的关键酶，本研究以成年小鼠为实验动物，主要用ＲＴ－ＰＣＲ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和免疫组织化 学的方法系统研究了ＣＳＤ在雌性和雄性生殖系统中ＣＳＤ的表达以及免疫组织化学定位。ＣＳＤ在 小鼠胚胎围着床期的变化规律，以及雌二醇和孕酮对小鼠子宫中ＣＳＤ表达的调控。主要研究内 容和结果包括以下四方面：
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ＣＳＤ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｕｔｅｒｕｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｕ ｂｌｏｔ．ＡＩＩ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
Ｄ９．Ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇｌｙ，ＣＳＤ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｕｍｉｎａｌ ａｎｄ ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ｓｉｔｅ ｏｎ Ｄ６ ａｎｄ ｕｔｅｒｎｔｕｂａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｏｎ Ｄ１８，ａｎｄ ｆｅｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ａｓ
一、首次证明雌性小鼠生殖系统中牛磺酸合成酶ＣＳＤ在ｍＲＮＡ和蛋白水平的表达，表明子 宫、输卵管和卵巢能通过ＣＳＤ通路合成和分泌牛磺酸。免疫组织化学研究结果表明，在发情周期 中，ＣＳＤ分布在子宫和输卵管所有上皮细胞和少数基质细胞。但是发情前期和发情期ＣＳＤ在血管 内皮细胞和平滑肌细胞的免疫反应比后期和间期强。ＣＳＤ存在于卵巢颗粒细胞层和初级卵泡到排 卵前卵泡的卵母细胞中，透明带和卵泡腔不表达ＣＳＤ，排卵后的黄体细胞也表达较强的ＣＳＤ。ＣＳＤ 的免疫反应随着卵泡闭锁和黄体退化在卵泡和黄体中而逐渐降低。
三、用卵巢摘除小鼠模型，研究了雌＝醇（Ｅ２）和孕酮（Ｐ４）对子宫中ＣＳＤ表达的调控。半 定量ＲＴ－ＰＣＲ。Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ和免疫组织化学检测结果都表明．卵巢摘除显著降低了子宫ＣＳＤ ｍＲＮＡ和蛋白表达的水平，各激素处理组都恢复了ＣＳＤ的表达水平，单独处理组中，Ｅ２的作用 晟强；单独注射Ｐ４以及Ｐ。和Ｅ２共同注射都促进了基质细胞中ＣＳＤ的表达。在模拟着床的激素 处理实验中，连续注射３天Ｐ４，第四天只注射Ｐ４的对照组（（Ｐ４）３＋Ｐ４）中，子宫腔的形态没有达 到坯胎着床的容受状态；而连续注射３天Ｐ４，第四天同时注射Ｅ２和Ｐ４的实验组（（Ｐ４ｂ＋Ｐ４十Ｅ２） 中，腺上皮和腔上皮有较强的ＣＳＤ表达，子宫腔的形态以及ＣＳＤ的表达都接近正常怀孕的子宫 状态。对照组和实验组都促进了基质细胞中ＣＳＤ的表达。ＣＳＤ与ＥＲａ免疫组织化学烈标记表明， ＣＳＤ和ＥＲａ主要共同存在于子宫腺和腔上皮细胞中。这些结果说明雌激素可能通过其受体商接 或间接参与调节子宫上皮和基质细胞中ＣＳＤ的分化表达以及ＣＳＤ的水平，从而调节牛磺酸含量 的变化。
Ⅱ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔａｕｒｉｎｅ（２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｉｓ ａ ｆｒｅｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ １３－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．Ｉｔ ｉｓ ｒｉｃｈ ｉｎ ｍａｍｍａｌ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｐｌａｙｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔａｕｒｉｎｅ ｉｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｓ ｎｏｔ ｓｔｉｌｌ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ．Ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｕｌｆｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ＣＳＤ） ｉｓ ｔｈｅ ｒａｔｅ－ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆｔａｕｒｉｎｅ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｗｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ＣＳＤ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｍａｔｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｍｉｃｅ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｐａｔｔｅｍ ｏｆ ＣＳＤ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｕｔｅｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｉ—ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＳＤ ｂｙ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｉｎ ｕｔｅｒｕｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ａｓ ｆｏｕｒ ｐａｒｔｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：
＿＝、发现ＣＳＤ在小鼠胚胎围着床期子宫中呈动态分布，Ｄ１和Ｄ２和正常发情周期子宫的表 达模式相同，只分布在上皮细胞和少数基质细胞中。从Ｄ３开始，基质细胞也表达较强的ＣＳＤ， 持续到Ｄ６；从Ｄ７开始变弱，逐渐消失。ＣＳＤ在Ｄ６着床点之间的部位和Ｄ１８与输卵管相连的 子宫部上皮细胞表现ＣＳＤ阳性，少数基质细胞表达ＣＳＤ，与朱孕小鼠子宫ＣＳＤ表达模式相似。 Ｄ４上午注射牛磺酸转运抑制剂Ｂ．丙氨酸降低了Ｄ９胚胎者床数和子宫内膜的厚度，表明牛磺酸 在胚胎着床中起到一定的作用。ＣＳＤ在小鼠子宫中的时空变化模式表明牛磺酸在胚胎发育和着 床期子宫容受性中起调节作用。
ｓｉｍｉｌａｒ ａｓ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎｐｒｅｇｎａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔａｕｄｎｅ，
１３－ａｌａｎｉｎｅ ｉｎｔｏ ａ ｕｔｅｒｉｎｅ ｈｏｍ ｏｎ Ｄ４ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｔｈａｔ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｏｎ Ｄ９．Ｔｈｅ ｔｅｍｐｏｒａｌ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＳＤ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｕｔｅｒｕｓ ｄｕｒｉｎｇ
ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｎｔｒｕｍ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｔａｉｎｅｄ，ＣＳＤ ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｆｉｖｉｔｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｒｐｕｓ ｌｕｔｅｍｎ ｄｕｒｉｎｇ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｔｒｅｓｉａ ａｎｄ ｃｏｒｐｕｓ ｌｕｔｅｕｍ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｄｗ ｔｈａｔ ＣＳＤ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔａｎｒｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｉｔａｌ ｏｒｇａｎｓ，
四、研究了ＣＳＤ在雄性小鼠生殖系统中的表达与分布，首次表明睾丸、附睾和输精管表达 ＣＳＤ ｍＲＮＡ利蛋白，表达水平从睾丸到附睾升高，输精管中最高。ＣＳＤ主要分布在睾丸的Ｌｅｙｄｉｇ 细胞和输出管、附睾以及输精管的上皮细胞和一些基质细胞中。从附睾头到附睾尾和输精管周围 的一些平滑肌细胞和基质细胞表达ＣＳＤ。曲细稽管内的Ｓｅｆｔｏｌｉ细胞和各级生精细胞以及附睾和 输精管中的精子不表达ＣＳＤ。这些结果表明雄性生殖器官可以通过ＣＳＤ合成通路合成牛磺酸。
知年j月2基日翩繇便册侧帆纠钏月谚日1主要仪器设备主要仪器及试剂组织包埋机湖北孝感医疗电子仪器厂石蜡切片机leica德国摊片机上海医疗仪器厂解剖显微镜motic显微镜olympusch30日本显微镜leicadivllb德国倒置显微镜leica德国显微摄影系统leicadfc320leicamicrosystemscambridge英国leicaqwin图像分析系统leica德国milliq超纯水器millipore美国c02培养箱thermo美国离心机北京医用离心机厂恒温水浴摇床哈尔滨东联电子公司凝胶成像系统alphalmagertm2200alphaeasefcsoftwarepackageversion321alphalnnotechcorporationca美国低温离心机5810reppendorfhamburg德国垂直电泳槽bioradlaboratoriesherculesca美国转膜仪bioradlaboratoriesherculesca美国琼脂糖水平电泳槽bioradlaboratoriesherculesca美国微型高速离心机eppendorhamburg德国2
综上所述，ＣＳＤ在小鼠生殖系统中具有时空特异性的表达模式，生殖系统能够通过ＣＳＤ通 路合成牛磺酸。ＣＳＤ在着床过程中呈动态分布，牛磺酸在胚胎着床过程中起着一一定的作用。雌激 素和孕激素调节ＣＳＤ在雌性小鼠生殖系统的表达水平。但是ＣＳＤ在生殖系统的活性、ＣＳＤ表达 水平和牛磺酸含量的关系以及牛磺酸在生殖系统的功能仍需进一步研究。 关键词：半胱亚磺酸脱羧酶，牛磺酸，雌二醇，孕酮，生殖系统，小鼠
ｐｅｒｉ—ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆｌ３－ａｌａｎｉｎｅ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｍｐｌｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆＣＳＤ ａｎｄ
ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆｔａｕｒｉｎｅ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｅｒΒιβλιοθήκη ｎｅ ｒｅｃｅｐｔｉｖｅｎｅｓｓ．
３．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＣＳＤ ｂｙ ｅｓｔｒｏｄｉａｌ（Ｅ２）ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ∞）ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｕｔｅｒｕｓ ｏｆ
ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ